Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin
Summary
Delle vescicole sinaptiche (SV) la bicicletta è il meccanismo di base della comunicazione intercellulare alle sinapsi neuronali. Rilascio e l’assorbimento della tintura di FM sono il mezzo primario di quantitativamente analizzante SV endo – ed esocitosi. Qui, mettiamo a confronto tutti i metodi di stimolazione per guidare FM1-43 ciclismo alla sinapsi Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) modello.
Abstract
FM coloranti vengono utilizzati per studiare il ciclo delle vescicole sinaptiche (SV). Queste sonde di amphipathic hanno una testa idrofila e coda idrofobica, rendendoli solubili in acqua con la possibilità di reversibilmente entrare ed uscire lipidici di membrana. Questi coloranti styryl sono relativamente non fluorescente in ambiente acquoso, ma inserire il foglietto esterno della membrana plasmatica provoca un > 40 X aumentare in fluorescenza. Nelle sinapsi neuronali, FM coloranti sono interiorizzati durante endocitosi SV, smerciata sia all’interno che tra piscine SV e rilasciato con esocitosi SV, fornendo un potente strumento per visualizzare le fasi presinaptici della neurotrasmissione. Un modello genetico primario di sviluppo di sinapsi glutammatergiche e funzione è la Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ), dove FM tingere imaging è stato ampiamente utilizzata per quantificare la dinamica di SV in una vasta gamma di condizioni mutante. Il terminale sinaptico NMJ è facilmente accessibile, con una bella serie di grandi boutons sinaptici ideale per applicazioni di imaging. Qui, mettiamo a confronto e contrasto i tre modi per stimolare la drosofila NMJ guidare tintura l’assorbimento/rilascio di attività-dipendente FM1-43: applicazione 1) vasca di alta [K+] a depolarizzarsi tessuti neuromuscolari, 2) del nervo motore elettrodo di aspirazione stimolazione a depolarizzarsi nervi presinaptici terminali e 3) mirati transgenici espressione delle varianti channelrhodopsin per luce-stimolato un controllo spaziale di depolarizzazione. Ciascuno di questi metodi presenta vantaggi e svantaggi per lo studio degli effetti di mutazione genetica sul ciclo SV presso la drosofila NMJ. Discuteremo di questi vantaggi e svantaggi per facilitare la scelta dell’approccio stimolazione, insieme con le metodologie specifiche per ogni strategia. Oltre a formazione immagine fluorescente, FM coloranti possono essere photoconverted a elettrone-densi segnali visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per lo studio dei meccanismi di ciclo SV a livello ultrastrutturale. Forniamo i confronti di confocale e la microscopia elettronica imaging da diversi metodi di stimolazione di Drosophila NMJ, per aiutare a guidare la selezione dei futuri paradigmi sperimentali.
Introduction
Il modello splendidamente caratterizzato Drosophila larvale della giunzione neuromuscolare (NMJ) glutamatergic sinapsi è stato utilizzato per studiare la formazione della sinapsi e funzione con un vasto spettro di perturbazioni genetica1. Il terminale del neurone di motore è costituito da più rami dell’assone, ognuno con molti boutons sinaptici allargata. Queste varicosità capiente (fino a 5 µm di diametro) contengono tutte la macchine di neurotrasmissione, comprese le vescicole sinaptiche glutamatergic uniforme (SVs; ~ 40 nm di diametro) nella riserva citosolico e facilmente rilasciabile piscine2. Queste vescicole attraccano a zone attive di sito del fusione di membrana presinaptica (AZs), dove l’esocitosi media il rilascio di neurotrasmettitore glutammato per trans-comunicazione sinaptica. Successivamente, il SVs vengono recuperato dalla membrana plasmatica tramite bacio-and-run riciclaggio o endocytosis clathrin-mediato (CME) per cicli ripetuti exo/endocitosi. La Drosophila NMJ è facilmente accessibile e ben adatto per isolamento e caratterizzazione di mutanti di ciclo SV. Utilizzando schermi genetici avanti, mutazioni novelle hanno portato all’identificazione di nuovi geni critici per il ciclo di SV3. Inoltre, approcci genetici inverso a partire con geni già noti hanno portato alla delucidazione dei meccanismi di ciclo nuovi SV attraverso la descrizione accurata del mutante ciclismo fenotipi4. La Drosophila NMJ è quasi ideale come preparazione per dissezione meccanismi di endocitosi ed esocitosi SV tramite metodi di otticamente della vescicola di pista in bicicletta durante la neurotrasmissione sinaptica sperimentale.
Una gamma di marcatori fluorescenti permettono tracking visivo delle vescicole durante la pedalata dinamica, ma il più versatile sono analoghi di tintura di FM che è sintetizzato per la prima volta da Mao, F., et al. 5. strutturalmente, FM coloranti contengono una testa idrofila e una coda lipofilica collegato attraverso un anello aromatico, con una regione centrale che conferisce proprietà spettrali. Questi styryl coloranti partizione reversibilmente in membrane, non ‘Flip-flop’ tra membrana volantini e così non sono mai gratuito nel citosol e sono molto più fluorescente in membrane di acqua5. Inserimento reversibile in un bilayer del lipido provoca un volta 40 aumento nella fluorescenza6. Alle sinapsi neuronali, gli esperimenti d’etichettatura di colorante classici di FM consistono di balneazione la preparazione sinaptica con la tintura durante la depolarizzazione stimolazione per caricare tintura via il endocytosis SV. Tintura esterna viene quindi lavata e il ciclo SV viene arrestato in una soluzione di ringer senza calcio all’immagine caricata sinapsi7. Un secondo ciclo di stimolazione in un bagno di tintura-libero innesca il rilascio di FM attraverso l’esocitosi, un processo che può essere seguito misurando la diminuzione di intensità di fluorescenza. Popolazioni di SV da una vescicola singola per piscine contenenti centinaia di vescicole possono essere quantitativamente monitorati6,7. FM coloranti sono stati utilizzati per sezionare la mobilitazione di attività-dipendente delle piscine SV funzionalmente distinte e per confrontare bacio-and-run vs CME ciclismo8,9. Il metodo è stato modificato alla separatamente saggio evocato, ciclo sinaptica spontanea e miniatura attività (con attrezzature altamente sensibile per rilevare le variazioni molto piccole di fluorescenza e ridurre photobleaching)10. Le analisi possono essere estesa a livello ultrastrutturale di photoconverting il segnale FM fluorescente in un’etichetta elettrone-densi per trasmissione microscopia elettronica11,12,13,14 .
Storicamente, la balneazione preparazioni sinaptiche in un’alta concentrazione di potassio (in appresso denominato “alta [K+]”) è stato il metodo di scelta per depolarizzazione stimolazione per indurre SV ciclismo; compreso tra la rana colinergici NMJ5, coltivate roditore cervello neuroni ippocampali15, per il modello16,di Drosophila glutamatergic NMJ17. Questo approccio [K+] alto è semplice, non richiede nessun attrezzature specializzate e pertanto è accessibile alla maggior parte dei laboratori, ma ha limitazioni per applicazione e interpretazione dei dati. Un metodo molto più fisiologicamente appropriato consiste nell’utilizzare l’aspirazione degli elettrodi di stimolazione elettrica del nervo4,5,12. Questo approccio unità terminale la propagazione del potenziale d’azione per stimolazione diretta dei nervi presinaptici e risultati possono essere confrontati direttamente per le analisi elettrofisiologiche di neurotrasmissione funzione13,14, 15, ma richiede attrezzature specializzate ed è tecnicamente molto più impegnativo. Con l’avvento di optogenetica, l’uso della stimolazione di un neurone channelrhodopsin ha altri vantaggi, tra cui uno stretto controllo spazio-temporale dell’espressione di canale utilizzando il binario sistema Gal4/UAS20. Questo approccio è tecnicamente molto più facile che la stimolazione di aspirazione elettrodo e non richiede niente di più di una sorgente di luce LED molto a buon Mercata. Qui, ci avvaliamo di formazione immagine della FM1-43 (dibromuro di pyridinium-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)N) sia e confrontare questi tre metodi di stimolazione diversi presso la drosofila NMJ: semplice alta [K+ ], sfidando channelrhodopsin elettrici e nuovi approcci.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alta [K+] Salina depolarizzazione stimolazione è di gran lunga la più semplice delle tre opzioni per tintura di FM di attività-dipendente in bicicletta, ma probabilmente il meno fisiologico29. Questo semplice metodo depolarizza ogni cellula accessibile nell’animale intero e così non permette studi diretti. Potrebbe essere possibile applicare localmente alta [K+] soluzione fisiologica con una micropipetta, ma questo sarà ancora depolarizzarsi cellule pre/post-sinaptica e …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri Broadie Lab per i contributi a questo articolo. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01s MH096832 e MH084989 di K.B. e nella comunione predoctoral NIH F31 MH111144 D.L.K
Materials
| SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
| Microscope Cover Glass 22×22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
| Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
| Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
| Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
| P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
| 0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
| HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
| Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
| Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
| 7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
| Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
| LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
| HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
| Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
| 20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
| Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
| Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
| Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
| 40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
| All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
| Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
| T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
| LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
| Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |
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