JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Neuroscience

FM fargestoff sykling Synapse: sammenligne høyt kalium Depolarization, elektrisk og Channelrhodopsin stimulering

Published: May 24, 2018
doi:
10.3791/57765
,
1Department of Biological Sciences,Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development,Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptiske vesicle (SV) sykling er kjernen mekanisme intercellulære kommunikasjon på neuronal synapser. FM fargestoff opptak og utgivelsen er hovedmåten å kvantitativt assaying SV endo- og exocytosis. Her sammenligne vi alle stimulering metoder for å drive FM1-43 sykling Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ) modell synapse.

Abstract

FM fargestoffer brukes til å studere synaptic vesicle (SV) syklusen. Disse amphipathic sonder har et hydrofile hode og hydrofobe hale, noe som gjør dem vannløselige med reversibel angi og avslutte membran lipid bilayers. Disse styryl fargestoffer er relativt ikke-fluorescerende i vandig medium, men innsetting ytre heftet av plasma membranen forårsaker en > 40 X økning i fluorescens. I neuronal synapser, er FM fargestoffer internalisert under SV endocytose, trafikkert både innenfor og mellom SV bassenger, og befridd med SV exocytosis, gir et kraftig verktøy for å visualisere presynaptic stadier av neurotransmission. En primær genetisk modell av glutamatergic synapse utvikling og funksjon er Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ), der FM fargestoff bildebehandling har vært brukt mye å kvantifisere SV dynamikken i en rekke mutant forhold. NMJ synaptic terminalen er lett tilgjengelig, med en vakker rekke store synaptic boutons ideelt for bildebehandlingsprogrammer. Her vi sammenligne og kontrast på tre måter å stimulere Drosophila NMJ å kjøre aktivitet-avhengige FM1-43 fargestoff opptak/release: 1) bad anvendelse av høy [K+] depolarize nevromuskulær vev, 2) enkel sugeevnen elektrode motor nerve stimulans til depolarize presynaptic nerve terminal, og 3) målrettet transgene uttrykk for channelrhodopsin varianter for lys-stimulert, romlig kontroll av depolarization. Hver av disse metodene har fordeler og ulemper for studier av genetisk mutasjon effekter på SV syklusen på Drosophila NMJ. Vi vil diskutere disse fordeler og ulemper å hjelpe valg av stimulering tilnærming, sammen med metodikkene som er spesifikke for hver strategi. I tillegg til fluorescerende bildebehandling kan FM fargestoffer photoconverted til elektron-tette signaler visualisert bruker overføring elektronmikroskop (TEM) for å studere SV syklus mekanismer på et ultrastructural nivå. Vi tilbyr sammenligninger av AC confocal og elektronmikroskop imaging fra ulike metoder for Drosophila NMJ stimulering, å hjelpe valg av fremtidige eksperimentelle paradigmer.

Introduction

Vakkert preget Drosophila larver nevromuskulær krysset (NMJ) glutamatergic synapse modellen er brukt til å studere synapse dannelse og fungere med et stort spekter av genetisk forstyrrelser1. Motor neuron terminalen består av flere axon avdelinger, hver med mange forstørret synaptic boutons. Disse capacious varicosities (opptil 5 µm i diameter) inneholder alle neurotransmission maskiner, inkludert uniform glutamatergic synaptic blemmer (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosolic reserve og lett releasable bassenger2. Disse vesikler dock på de presynaptic plasma membranen fusion aktive områdene (AZs), der exocytosis formidler glutamat nevrotransmitter utgivelsen for trans-synaptic kommunikasjon. Senere, hentes SVs fra plasma membranen via kyss-and-run resirkulering eller clathrin-mediert endocytose (CME) for gjentatte exo/endocytose sykluser. Drosophila NMJ er lett tilgjengelig og godt egnet for både isolere og karakterisere SV syklus mutanter. Bruke frem genetisk skjermer, har romanen mutasjoner ført til identifisering av nye gener kritisk for SV syklus3. Videre har omvendt genetisk tilnærminger starter med allerede kjent gener ført til utviklingen av nye SV syklus mekanismer gjennom forsiktig beskrivelse av mutant sykling fenotyper4. Drosophila NMJ er nesten perfekt som en eksperimentell synaptic forberedelse for dissekere SV endocytose og exocytosis mekanismer via metoder å optisk spor vesicle Sykling under neurotransmission.

En rekke fluorescerende markører tillate visuell sporing av blemmer under sykling dynamics, men den mest allsidige er FM fargestoff analogs som er først syntetisert av Mao, F., et al. 5. strukturelt, FM fargestoffer inneholder en hydrofile hode og en lipofile hale knyttet gjennom en aromatiske ringen, et sentralt område overdragelse spektrale egenskapene. Disse styryl fargestoffer partisjonere reversibel i membraner, ikke ‘flip-flop’ mellom membran brosjyrer og så er aldri gratis i stoffer, og er langt mer fluorescerende i membraner vann5. Reversibel innsetting en lipid bilayer forårsaker en 40-fold økning i fluorescens6. På neuronal synapser består klassisk FM fargestoff merking eksperimenter av bading synaptic utarbeidelse med fargestoff under depolarizing stimulering laste fargestoff via SV endocytose. Eksterne fargestoff deretter vasket bort og SV syklusen er arrestert i en kalsium-gratis ringe løsning å image lastet synapser7. En ny runde med stimulering i en dye-fri bad utløser FM utgivelse gjennom exocytosis, en prosess som kan følges ved å måle fluorescens intensitet reduksjon. SV bestander fra en enkelt vesicle å bassenger som inneholder hundrevis av blemmer kan være kvantitativt overvåkede6,7. FM fargestoffer har blitt brukt til å dissekere aktivitet-avhengige mobilisering av funksjonelt forskjellige SV bassenger og sammenligne kyss-and-run vs CME sykling8,9. Metoden er endret til separat analysen fremkalt, spontane og miniatyr synaptic syklus aktiviteter (med svært følsom utstyr å oppdage svært liten fluorescens endringer og redusere photobleaching)10. Analyser kan utvides til ultrastructural nivå ved photoconverting fluorescerende FM signalet til et elektron-tette etikett for overføring elektronmikroskop11,12,13,14 .

Historisk bading synaptic forberedelser i en høy konsentrasjon av kalium (heretter referert til som “high [K+]”) har vært metoden for valg for depolarizing stimulering å indusere SV syklingen. mellom frosk cholinergic NMJ5, kultivert gnager hjernen hippocampus neurons15 Drosophila glutamatergic NMJ modell16,17. Denne høy [K+] tilnærmingen er enkel, krever ingen spesialisert utstyr, og er derfor tilgjengelig for de fleste laboratorier, men har begrensninger for både programmer og data tolkning. En mye mer fysiologisk metoden er å bruke sugekraft elektrode elektrisk stimulering av nerve4,5,12. Denne tilnærmingen kjører handlingen potensial overføring for direkte stimulering av presynaptic nerve terminal, og resultatene kan være direkte forhold til elektrofysiologiske analyser av neurotransmission funksjonen13,14, 15, men krever spesialisert utstyr og er teknisk mye mer utfordrende. Bruk av optogenetics har bruk av channelrhodopsin nevrale stimulering flere fordeler, inkludert tett spatiotemporal kontroll over kanalen uttrykk med de binære Gal4/UAS system20. Denne tilnærmingen er teknisk mye lettere enn sugekraft elektrode stimulering og krever ikke annet enn en veldig billig LED-lyskilde. Her, brukes avbilding av FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) å både sammenligne metodene for tre ulike stimulering i Drosophila NMJ: enkel høy [K+ ], utfordrende elektriske og nye channelrhodopsin tilnærminger.

Protocol

1. larver lim disseksjon Grundig blande 10 deler av silikon-elastomer base med 1 del av silikon-elastomer herding agent fra elastomer kit (Tabell for materiale). Coat 22 x 22 mm glass coverslips med elastomer og kur på en varm plate på 75 grader i flere timer (inntil lenger klissete å ta). Plassere en enkelt elastomer-belagt glass dekkglassvæske i skreddersydde plexi glass disseksjon kammeret (figur 1, nederst) i forberedelse til larver diss…

Representative Results

Figur 1 viser arbeidsflyten for aktivitet-avhengige FM fargestoff imaging protokollen. Eksperimentet begynner alltid med samme larver lim dissection, uansett stimulering senere. Figur 1a er en skjematisk av en dissekert larve, viser ventrale nervesystemet (VNC), utstråler nerver og gjentatte hemisegmental muskel mønster. VNC fjernes og utarbeidelse badet i en 4 µM løsning av FM1-43 (figur 1b, ros…

Discussion

Høy [K+] saltvann depolarizing stimulering er den enkleste av de tre alternativene for aktivitet-avhengige FM fargestoff sykling, men sannsynligvis den minste fysiologiske29. Denne enkle metoden depolarizes hver tilgjengelig celle i hele dyret, og så tillater ikke rettet studier. Det kan være mulig å bruke lokalt høy [K+] saline brønnene med, men dette vil fortsatt depolarize pre/postsynaptic celler og sannsynlig synapse-assosiert glia1. Et annet…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Broadie Lab medlemmer for bidrag til denne artikkelen. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01s MH096832 og MH084989 til K.B., og NIH predoctoral fellesskap F31 MH111144 til D.L.K.

Materials

SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22×22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. . Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , (2012).
  28. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

FM DyeSynaptic Vesicle CyclingNeuromuscular JunctionDrosophila LarvaeHigh Potassium DepolarizationElectrical StimulationOptogeneticsAnti-HRP AntibodyElastomer-coated CoverslipDissectionGluingMotor NerveCalcium-free SalineSuction PipetteMicroelectrode PullerMicro ForgeMicromanipulator
check_url/57765?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image