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Neurosciences

Tinte de FM ciclismo en la sinapsis: comparación de potasio alto despolarización, eléctrico y Channelrhodopsin estimulación

Published: May 24, 2018
doi:
10.3791/57765
,
1Department of Biological Sciences,Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development,Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Vesícula sináptica (SV) ciclismo es el mecanismo principal de comunicación intercelular en las sinapsis neuronales. Liberación y absorción del tinte de FM son los medios primarios de análisis cuantitativo de la SV endo – y exocitosis. Aquí, comparamos todos los métodos de estimulación para conducir bicicleta en la sinapsis de Drosophila Unión neuromuscular (NMJ) modelo FM1-43.

Abstract

FM colorantes se utilizan para estudiar el ciclo de la vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfipáticos tienen una cabeza hidrofílica y cola hidrofóbica, haciéndolos hidrosolubles con la capacidad reversible entrar y salir de bicapas de lípidos de membrana. Estos tintes styryl son relativamente no-fluorescentes en medio acuoso, pero causa la inserción en el prospecto externo de la membrana plasmática una > 40 X aumento en fluorescencia. En las sinapsis neuronales, tintes de FM son internalizados durante la endocitosis SV, víctimas de la trata dentro y entre piscinas SV y lanzado con exocitosis SV, proporcionando una potente herramienta para visualizar etapas presinápticas de la neurotransmisión. Un modelo genético primario de desarrollo de sinapsis glutamatérgica y de la función es la Drosophila Unión neuromuscular (NMJ), donde FM teñir la proyección de imagen se ha utilizado extensivamente para cuantificar la dinámica de la SV en una amplia gama de condiciones mutantes. La terminal sináptica NMJ es fácilmente accesible, con una hermosa gama de grandes botones sinápticos ideales para aplicaciones de imagen. Aquí, comparar y contrastar las tres formas de estimular la Drosophila NMJ conducir dependiente de actividad FM1-43 tinte absorción/release: aplicación 1) baño de alto [K+] despolarizar los tejidos neuromusculares, 2) nervio motor electrodo de succión estímulo para despolarizar el nervio presynaptic terminal y 3) objetivo expresión transgénica de channelrhodopsin variantes para el control espacial, estimulado por la luz de despolarización. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas para el estudio de los efectos de la mutación genética en el ciclo SV en la Drosophila NMJ. Vamos a discutir las ventajas y desventajas para ayudar a la selección del enfoque de estimulación, junto con las metodologías específicas para cada estrategia. Además de la proyección de imagen fluorescente, tintes de FM pueden ser photoconverted a las señales de electrón-densos visualizados mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para estudiar mecanismos de ciclo SV a nivel ultraestructural. Proporcionamos las comparaciones de confocal y microscopia electrónica de la proyección de imagen de los diferentes métodos de estimulación de la NMJ de Drosophila , para ayudar a guiar la selección de futuros paradigmas experimentales.

Introduction

El modelo glutamatérgica y sinapsis maravillosamente caracterizada Drosophila Unión neuromuscular larvaria (NMJ) se ha utilizado para estudiar la formación de sinapsis y función con un vasto espectro de perturbaciones genéticas1. El terminal de la neurona de motor consiste en múltiples ramas del axón, cada uno con muchos botones sinápticos ampliadas. Estas várices de gran capacidad (hasta 5 μm de diámetro) contienen toda la maquinaria de la neurotransmisión, incluyendo vesículas sináptica glutamatérgica uniforme (SVs; ~ 40 nm de diámetro) en la reserva citosólica y fácilmente liberable piscinas2. Estas vesículas atracan en las membrana plasmática presináptica fusión sitio zonas activas (AZs), donde exocitosis interviene en la liberación de neurotransmisores de glutamato para trans-comunicación sináptica. Posteriormente, la Superintendencia se recupera de la membrana del plasma vía reciclaje beso-y-funcione o endocitosis mediada por clatrina (CME) para los ciclos repetidos de exo/endocitosis. La Drosophila NMJ es fácilmente accesible y adecuado para aislar y caracterizar a mutantes de ciclo SV. Utilizando pantallas genéticas adelantados, mutaciones han conducido a la identificación de nuevos genes críticos para la SV ciclo3. Por otra parte, enfoques genéticos inversos a partir de genes ya conocidos han llevado al esclarecimiento de nuevos mecanismos de ciclo SV por la cuidada Descripción de mutante ciclismo fenotipos4. La Drosophila NMJ es casi ideal como una preparación experimental sináptica para diseccionar los mecanismos de endocitosis y exocitosis SV mediante métodos que ópticamente vesícula de pista de ciclismo durante la neurotransmisión.

Una gama de marcadores fluorescentes permiten seguimiento visual de las vesículas durante el ciclo de la dinámica, pero el más versátil es análogos de tinte de la FM que primero es sintetizado por Mao, f el., et al. 5. estructuralmente, FM tintes contienen una cabeza hidrofílica y una cola lipofílica conectados a través de un anillo aromático, con una región central que confieren propiedades espectrales. Estos styryl tintes reversible de la partición en las membranas, no ‘flip-flop’ entre los folíolos de la membrana y así nunca son libres en el citosol y son mucho más fluorescentes en las membranas de agua5. Inserción reversible en una bicapa de lípidos provoca un 40-fold aumento en fluorescencia6. En las sinapsis neuronales, clásica FM tinte etiquetado los experimentos consisten en bañar la preparación sináptica con el tinte durante la despolarización estimulación cargar tinte mediante endocitosis SV. Tinte externo luego es lavado y el ciclo SV es detenido en una solución de ringer sin calcio a la imagen cargada sinapsis7. Una segunda ronda de estímulo en un baño de tinte provoca liberación de FM a través de exocitosis, un proceso que puede seguirse midiendo la disminución de la intensidad de fluorescencia. Poblaciones de SV de una sola vesícula a piletas que contienen cientos de vesículas pueden ser monitoreada cuantitativamente6,7. Tintes de FM se han utilizado para disecar movilización dependiente de actividad de piscinas SV funcionalmente distintas y comparar kiss y gestión vs CME ciclismo8,9. El método ha sido modificado por separado ensayo evocado, ciclo sináptica espontánea y miniatura actividades (con equipo altamente sensible para detectar cambios de fluorescencia muy pequeña y reducir el fotoblanqueo)10. Análisis pueden ampliarse a nivel ultraestructural por photoconverting la señal de FM fluorescente en una etiqueta de electrón-densos para transmisión microscopia electrónica11,12,13,14 .

Históricamente, preparaciones sináptica bañarse en una alta concentración de potasio (en lo sucesivo denominado “alto [K+]”) ha sido el método de elección para despolarización estimulación para inducir SV ciclismo; desde la rana colinérgicos NMJ5, cultivadas roedores cerebro neuronas hippocampal15, a la Drosophila glutamatérgica NMJ modelo16,17. Este enfoque [K+] alta es simple, no requiere ningún equipo especializado y por lo tanto es accesible a la mayoría de los laboratorios, pero tiene limitaciones de aplicación y la interpretación de los datos. Un método mucho más fisiológico apropiado es utilizar electrodo de succión estimulación eléctrica del nervio4,5,12. Este enfoque conduce a potencial de acción propagación para la estimulación directa del nervio presináptico terminal y resultados pueden ser directamente comparados con los ensayos electrofisiológicos de neurotransmisión función13,14, 15, pero requiere equipo especializado y es técnicamente mucho más difícil. Con el advenimiento de optogenetics, el uso de la estimulación neuronal channelrhodopsin tiene ventajas adicionales, incluyendo el estricto control spatiotemporal de la expresión del canal utilizando el binario de sistema de Gal4/UAS20. Este enfoque es técnicamente mucho más fácil que el estímulo de succión del electrodo y requiere nada más que una fuente de luz LED muy barata. Aquí, utilizamos proyección de imagen de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibromuro de piridinio) a comparar y contrastar estos tres métodos diferentes de estimulación en la Drosophila NMJ: alta simple [K+ ], desafiando channelrhodopsin eléctricos y nuevos enfoques.

Protocol

1. larvas pegamento disección Mezclar bien 10 partes de elastómero de silicona base con 1 parte de elastómero de silicona curado a agente del kit del elastómero (Tabla de materiales). Capa de cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm con el elastómero y el cura sobre una placa caliente a 75 ° c durante varias horas (hasta que ya no es pegajoso al tacto). Coloque un cubreobjetos de vidrio solo revestimiento de elastómero en la sala de disección de cristal plexi a medida (<…

Representative Results

La figura 1 muestra el flujo de trabajo para el tinte de FM dependientes de la actividad de protocolo. El experimento comienza siempre con la misma disección cola larvaria, independientemente del método de estimulación utilizado posteriormente. Figura 1a es un diagrama esquemático de una larva disecada, el cordón nervioso ventral (VNC), irradiando los nervios y hemisegmental repetido patrón de músculo. La VNC se retira y l…

Discussion

Alta estimulación despolarización salina [K+] es por lejos el más fácil de las tres opciones para teñir de FM dependientes de actividad ciclismo, pero probablemente la menos fisiológica29. Este sencillo método despolarizan cada célula accesible en el animal entero y por lo tanto no permite estudios dirigidos. Es posible aplicar localmente alta [K+] solución salina con una micropipeta, pero esto todavía despolarizar pre/postsynaptic células y probable glia sinapsis …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros de Broadie Lab contribuciones a este artículo. Este trabajo fue financiado por los NIH R01s MH096832 y MH084989 a K.B. y beca predoctoral NIH MH111144 F31 a D.L.K.

Materials

SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22×22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity
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References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. . Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , (2012).
  28. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).
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