Identification de marqueurs de Virulence de Mycobacterium abscessus de réplication intracellulaire dans les Phagocytes

Summary

Nous présentons ici deux protocoles pour étudier les interactions Phagocyte -Mycobacterium abscessus : le criblage d’un transposon mutant pour carence intracellulaire bactérienne et la détermination des bactéries intracellulaire transcriptome de l’ARN séquençage. Les deux approches offrent un aperçu des avantages génomiques et transcriptomique des adaptations améliorant l’aptitude des bactéries intracellulaires.

Abstract

Ce qui le différencie des autres mycobactéries saprophytes Mycobacterium abscessus , c’est la capacité à résister à la phagocytose par les macrophages humains et la capacité de se multiplier à l’intérieur de ces cellules. Ces traits de caractère de virulence rendent M. abscessus pathogène, en particulier chez les hôtes vulnérables ayant une maladie pulmonaire structurelles sous-jacentes, telles que la fibrose kystique, dilatation des bronches ou la tuberculose. Comment les patients deviennent infectées par M. abscessus reste floue. Contrairement à nombreuses mycobactéries, M. abscessus ne se trouve pas dans l’environnement, mais pourrait résident à l’intérieur des amibes, les phagocytes environnementales qui représentent un réservoir potentiel pour M. abscessus. En effet, M. abscessus est résistant à la phagocytose amibiennes et la vie intra-amibe semble augmenter M. abscessus virulence dans un modèle expérimental d’infection. Cependant, on connaît M. abscessus virulence en soi. Pour déchiffrer les gènes conférant un avantage à M. abscessus vie intracellulaire, un criblage d’un transposon M. abscessus mutant a été développé. En parallèle, il a développé une méthode d’extraction de l’ARN des mycobactéries intracellulaires après co-culture avec des amibes. Cette méthode a été validée et a permis le séquençage de l’ensemble M. abscessus transcriptomes l’intérieur des cellules ; fournir, pour la première fois, une vue globale sur M. abscessus adaptation à la vie intracellulaire. Ces deux approches nous donnent un aperçu des facteurs de virulence de M. abscessus qui permettent à M. abscessus coloniser les voies respiratoires chez l’homme.

Introduction

Le genre Mycobacterium comprend des espèces allant des organismes saprophytes inoffensifs aux principaux agents pathogènes humains. Les espèces pathogènes notoires comme Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum et Mycobacterium ulcerans appartiennent au sous-groupe de croissance lente mycobactéries (SGM). En revanche, le sous-groupe de croissance rapide mycobactéries (RGM) se caractérise par leur capacité à former des colonies visibles en moins de 7 jours, sur un milieu gélosé. Le groupe RGM comprend plus de 180 espèces, principalement des mycobactéries saprophytes non pathogène. Études sur les interactions avec leurs hôtes RGM ont ....

Protocol

1. criblage

1. Construction de la bibliothèque de mutant de Tn
   1. Obtenir une bibliothèque transposon.
      Remarque : Pour cette expérience, une bibliothèque mutante transposon a été obtenue de E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA. La bibliothèque a été construite d’une souche lisse clinique (43 s) de M. abscessus complexes (M. abscessus subsp massiliense) avec un phagemid introduit dans M. abscessus permettant l’insertion aléatoire d’un seul Tn dans un dinucléotide TA (91 240 séquences TA dans le génome de M. abscessus ). Pour plus d’informations, consulte....

Results

M. abscessus a la capacité de résister et de s’échapper des réponses bactéricides des macrophages et environnementales protozoaires comme les amibes. M. abscessus exprime des facteurs de virulence lorsqu’il est cultivé au contact des amibes, qui le rend plus virulent en souris⁴. Le premier objectif de ces méthodes a été d’identifier les gènes présents dans M. abscessus permettant sa survie et la multiplication dans les amibes.

Discussion

Le comportement de M. abscessus est beaucoup plus semblable au comportement de SGM pathogène tels que M. tuberculosis que n’importe quel autres mycobactéries appartenance à RGM². L’élément clé de la pathogénicité du SGM est leur capacité à survivre ou même multiplier au sein des cellules présentatrices d’antigène, tels que les macrophages et les cellules dendritiques.

M. abscessus a acquis certains avantages génomiques, comme en témoigne la sé.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du matériau/ de l’équipement
Plaques 24 puits	Thermofisher	11874235
Plaques 96 puits	Thermofisher	10687551
Beadbeater  ;	Bertin	Precellys 24
Bioanalyseur	Agilent
Genepulser Xcell	Biorad
Nanodrop spectrophotomètre 2000	Thermofisher
QuBit fluorimètre	Thermofisher	Q33226
billes de zirconium/billes de silice	Produits Biospec	11079101Z	Perles
Nom du réactif/des cellules
Acanthamoeba  ; Castellanii  ;	ATCC	30010	souche
Amikacin  ;	Mylan	150927-A	poudre
B-mercaptoéthanol  ;	Sigma-Aldrich	M6250	solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	>93 % granulaire anhydre
Chloroforme  ;	Fluka	25666	solution
ClaI enzyme	New England Biolabs	R0197S	enzyme
Columbia agar  ;	Biomérieux	43041	90 mm
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270  ;	poudre
DMEM  ;	Thermofisher	11500596	eau moyenne
sans DNase et RNase  ;	Invitrogen	10977-035	solution
E.  ; coli électrocompétent	Thermofisher	18265017	bactéries
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884	poudre
Escherichia coli  ;	Isolat clinique	bactéries	de stock personnel
Fe(NH4)2(SO4)-6H20  ;	EMS	15505-40	solution sulfatée aqueuse à 4 %
sérum de veau fœtal	Gibco	10270	sérum
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516	solution
thiocyanate de guanidium  ;	Euromedex	EU0046-D
poudre Isopropanol  ;	Sigma-Aldrich	I9516	solution
J774.2 macrophages	Sigma-Aldrich	J774.2	souche
kanamycine  ;	Sigma-Aldrich	60615	poudre
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	Monobasique, anhydre
LB milieu liquide  ;	Invitrogen	12795-027	poudre
Lysozyme	Roche	10837059001	poudre
MgSO4	Labosi	M275	pur
Microbank TM (cryotubes avec billes)	Pro-Lab Diagnostic	PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium	Sigma-Aldrich	M0428	poudre
Middlebrook 7H9 medium	Thermofisher	11753473	poudre
Mü ; ller-Hinton agar	Biorad	3563901	poudre
N-Lauryl-sarcosine	Merck	S37700 416	poudre
Na2HPO4-7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	98-102 %
Phenol/chloroforme  ;	Sigma-Aldrich	77617	solution
Protéinase K	Thermofisher	EO0491	poudre
protéose peptone	BD	211684	digestion enzymatique des tissus animaux
plasmide pUC19	New England Biolabs	54357	plasmide
SDS  ; 20 %	Biorad	1610418	solution
Citrate de sodium	Calbiochem	567446	poudre
Thiourea	, Sigma-Aldrich	88810	poudre
Tris	Sigma-Aldrich	154563	poudre
Trizol  ;	Thermofisher	12044977	solution
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754  ;	solution
Extrait de levure  ;	BD	212750
Kit
AMBION DNase kit  ;	Thermofisher	10792877	kit
ADN Agilent Chip	Agilent	5067-1504	kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  ;	Kit Thermofisher	K0503
Kit de purification PCR PureLink Kit	K310001	Invitrogen	Kit
dosages Quant-It" Kit	Thermofisher	Q33140/Q32884	Kit
T4 ADN ligase  ;	Invitrogen	Y90001	kit
de préparation TruSeq Stranded RNA LT Kit	de 15032611		Illumina