이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.
단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 단일 셀 검색 하 고 개별 RNA 분자를 계산 하는 능력 때문에 유전자 발현을 연구 하는 강력한 기술입니다. 깊은 시퀀싱 기반 방법 보완, smFISH 사본에 셀 변화와 특정된 RNA의 subcellular 지 방화에 대 한 정보를 제공합니다. 최근, 우리 사용 smFISH 신진 효 모 감수 분열 동안 NDC80 유전자의 표현 연구, 어느 두 기록에서 isoforms 존재 하 고 짧은 사본 isoform는 긴 isoform와 공유의 전체 시퀀스. 각 사본 isoform를 자신 있게 식별 하려면 우리는 알려진된 smFISH 프로토콜을 최적화 하 고 높은 일관성과 신진 동안 샘플에 대 한 smFISH 데이터의 품질을 얻은 감수 분열 효 모. 여기, 우리는이 최적화 된 프로토콜, 우리 smFISH 데이터의 고품질 얻을 여부 및 다른 효 모 종자와 성장 조건에서이 프로토콜을 구현 하기 위한 몇 가지 팁을 확인 하는 데 사용할 조건을 설명 합니다.
유전자 발현의 동적 규칙 물질 대사에 유기 체, 환경 스트레스, 감염, 그리고 변화에 응답의 개발 드라이브. RNA 풍부를 측정 하는 기술에 의존 하는 transcriptional 규칙에 집중 하는 연구. 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH), 불리 한 그러한 방법, 단일 셀1,2개별 RNA 분자의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이 메서드는 셀 유전자 발현의 측정 및 세포내 RNA 지역화의 결정을 수 있습니다.
가장 일반적으로 사용된 smFISH 기술, 개별 RNA 분자의 탐지 여러 짧은 DNA 프로브를 (종종 ~ 48 20-메 르 프로브) 대상 RNA 보완 하 고 같은 형광 염료를 활용 합니다. 약한 신호 귀착되는 단일 형광 프로브의 바인딩 하지만 모든 프로브의 앙상블에서 신호는 강력한. 이 기능은 크게 단일 프로브 오프 대상 바인딩 전시 수 있습니다, 비록 이러한 신호는 될 것으로 예상 매우 약한 대상 RNA 분자3의 비교 때문에 신호 대 잡음 비율을 향상 시킵니다. 오류 검출, 내 RNA 분자의 수는 계산 고 다양 한 성장 조건 및 다른 뮤턴트 들을 비교 될 수 있습니다.
첫 번째 개발, 이후 smFISH 맞게 조정 되었습니다 유전자 식4, 녹음 방송 신장1,2,5,6,7 을 파열 transcriptional 접합 등의 다양 한 측면을 연구 하 , 8 , 9, 세포내 유전자 식10,11,12, 그리고 RNA 지역화13,,1415. 최근에, 우리는이 방법을 사용 하는 동일한 유전자의 두 사본 isoforms의 표정을 연구 하 짧은 사본 isoform (NDC80ORF) 긴 isoform (NDC80luti 와 공유의 전체 순서는 )16. 두 개의 mRNA isoforms를 고유 하 게 식별 하려면 사용 하는 두 개의 프로브 세트: 1 세트 NDC80luti의 독특한 시퀀스에 특정 이며 다른 설정, 다른 형광 성 염료에 활용 된 두 개의 isoforms의 공통 영역에 바인딩합니다. NDC80luti RNA로 식별 됩니다 colocalized 자리 두 형광 신호, 반면에 NDC80ORF RNA만 일반적인 프로브 세트에서 신호를 포함 하는. 수 이후는 NDC80ORF 성적 조사 교 잡의 높은 효율성과 높은 신호 대 잡음 비율은 자신 있게 smFISH 관광 명소를 식별 하 고 오류를 감소 하는 데 필요한 “빼기” 방법에 의해 계산 번 식입니다.
이 문서는 싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 smFISH를 수행 하기 위한 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜, 휴대폰 번호, 고정 시간, 소화, 소화 버퍼, 프로브 농도, 시간과 교 잡에서 버퍼 smFISH 실험을 위해 사용 했다 SK1 긴장의 배경 S. cerevisiae 겪고 식물에 대 한 최적화 된 성장 또는 감수 분열입니다. 그러나, 우리는 또한이 원고에 참고: (1) 이미지 수집, 및 (2) 다른 스트레인 배경 및 성장 조건에 대 한 추가적인 최적화 필요할 수 있는 프로토콜의 단계 후 smFISH 데이터의 품질을 확인 하는 메서드.
여기에 제시 된 프로토콜 다른 게시 된 smFISH 프로토콜2,3,21,,2223에서 파생 되 고 효 모 스트레인 배경 SK1 최적화입니다. 최적화 된 매개 변수 셀 번호, 고정 기간, 원심 분리 속도 기간, 소화 기간, 소화 버퍼, 프로브 농도 및 교 잡 버퍼 포함. 교 잡 온도 기간 같은 다른 매개 변수 최적화 하지 했다. 이 섹션에서 우리는이 프로토콜 어떤 효 모 스트레인 배경 및 관심사의 성장 조건에 적응 하는 데 도움이 될 몇 가지 메모를 공유.
싹 트는 효 모의 세포 벽은 프로브 삽입을 방지 하는 세포 벽 때문에 싹 트는 효 모에 높은-품질 smFISH 이미지를 획득 하는 것에 대 한 하나의 주요 도전 이다. Zymolyase에 의해 세포 벽의 불완전 한 소화는 프로브와 신호에 높은 셀 다양성의 비효율적인 교 잡 이끌어 낸다. 그러나, 이상의 소화 수 셀 너무 연약 할 중요 한 선도 세척 단계 동안 손실 셀 및 셀 이미징에 대 한 슬라이드 준비 중 붕괴. 따라서, 소화 기간 최적화 매우 중요입니다. 서로 다른 양의 시간에 대 한 동일한 샘플을 소화 하 여 파일럿 smFISH 실험을 실시 하는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 우리 최고의 smFISH 데이터를 얻은 하는 셀의 ~ 80%가 비 굴절 될 때 우리가 소화 중지. 일반적으로, 동일한 성장 조건에 대 한 다른 유전자 돌연변이 체 긴장 비슷한 타이밍으로 소화 될 수 있습니다. 그러나, 소화 기간 다른 성장 조건 및 싹 트는 효 모에 감수 분열의 다른 단계 사이에서 비교 될 때 다릅니다. 타이밍 결정 되 면 smFISH의 품질이 재현 합니다. 참고 결함 세포 벽 합성 또는 구성 돌연변이 체 긴장에 대 한 소화 zymolyase의 다른 배치의 사용 미만 15 분 내에 완료 될 수 있습니다 또한 약간 소화 타이밍을 변경할 수 있습니다.
최적의 프로브 농도 높은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 필요 합니다. 우리가 설계 하 고 상업적으로 우리의 smFISH 프로브를 구입. 좋은 프로브 (종종 20-메) GC 35%에서 45%, 프로브, 그리고 낮은 분 사이 2 기본적인 쌍의 최소 간격 사이의 비율을 가져야 한다. 우리 프로브, 목록을 생성 하는 제조 업체에서 웹 기반 조사 디자이너를 사용 하 고 충분 한 프로브에서 선택할 수 있다면, 우리는 알고리즘을 사용 폭발 Saccharomyces 게놈 데이터베이스에서 이상의 17 자료 쌍 겹쳐 프로브를 제거 하 과 다른 게놈 영역입니다. 우리는 더 많은 photostable 형광 염료 (CAL Fluor 590) 때문에이 세트에서 (20 프로브) 위의 기준을 모두 만족 하는 프로브 수 보다 낮은 NDC80luti (CF 590)의 독특한 영역에 anneals 프로브 세트에 대 한 선택은 (~ 25 프로브) 제조업체에서 권장 하는 최소 수입니다. 제조업체의 지침에 따라 프로브 솔루션, 재구성 후 우리가 만든 1시 10분 희석 재고 솔루션의 희석된 솔루션-20 ˚C에서 5 µ L aliquots에 저장. 각 약 수 한 번만 사용 되었다. 최적화, 하나 직렬 해야 희석 1:10에서 희석 솔루션 및 테스트 어느 농도 수익률 최상의 신호 대 잡음 비율. 1: 250, 1: 500, 1:1000, 및 원래 주식에서 1: 2000의 희석 시리즈를 만드는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 1: 500 희석 요인 CF 590 및 Q 670 프로브 세트에 대 한 최상의 신호 대 잡음 비율 귀착되는.
최적의 고정 시간 성공적인 smFISH 신진 효 모에 대 한 중요 한 이기도합니다. 우리는 하룻밤 고정 4 ˚C에서 발견 보다는 크게 meiotic 샘플에 대 한 smFISH 결과의 품질과 일관성을 개선 20 분 동안 실내 온도에 고정. 우리는 테스트 하지 않지만 고정 식물 샘플 영향을 줄 수 어떻게 하룻밤, 실 온에서 고정이 성장 조건을 잘 일했다. 따라서, 새로운 긴장 또는 성장 조건에 대 한 smFISH 프로토콜을 최적화 하려면 좋습니다 실내 온도에 짧은 고정 시간으로 시작 하 고 증가 하는 고정 시간 신호의 높은 다양성 발생 하는 경우.
다른 게시 프로토콜3,,2223와 비교해, 우리의 프로토콜 소화와 교 잡 동안 VRC의 높은 농도 중 VRC RNase 억제제를 사용 합니다. 이 두 단계에의 VRC 추가 향상 smFISH 결과의 일관성 가능성이 더 나은 nuclease 활동, zymolyase 믹스 (효소 원유 추출 물에서 정화와 RNase 포함 될 수 있습니다에 의해 도입 될 수 있습니다에 대 한 RNA 분자를 보존 오염 물질)입니다. 따라서, 우리의 프로토콜 또는 VRC의 최적화를 위한 더 높은 농도에 나와 VRC의 금액을 사용 하는 것이 좋습니다.
셀의 상당 부분 버퍼 B에 formamide 워시 버퍼 세척 단계 동안 손실 될 수 있습니다. 셀 손실을 줄이기 위해, 하나는 원심 분리 속도 증가할 수 있었다. 우리의 경우, 버퍼 B 동안 우리의 샘플 작은를 고속 (21000 x g)를 사용 하 여 씻어 크게 감소 셀 손실. 그러나, 셀 될 zymolyase 소화 후 매우 깨지기 쉬운 그래서 원심 분리 속도 변경 권장 되지 않습니다. 대신, 셀 formamide 워시 버퍼에서 세척 하는 동안 작은 도움이 크게 미국 과학에서 낮은 접착 튜브 사용 하 여 하는 것이 좋습니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜 지속적으로 효율적인 이미징 충분히 밀도 세포의 단층을 생성할 수 있습니다. 일반적으로, 7 시야를 산출 해야 한다 > 130 셀 정량화에 적합.
마지막으로, 그것은 대 한 최적의 이미지 분석에서 필요한 출력을 결정 하는 것이 중요입니다. SmFISH 관광 명소를 검색, 게시 된 분석 프로그램 일반적으로 배경 신호를 제거 하려면 가우스 알갱이 사용 하 여 원시 이미지를 필터링 하 고 이미지2,17의 각 집합에 대해 사용 하 여 신호 대 잡음 비율을 결정 하기 위해 사용자에 게 요청. 불행히도, 거기 현재는 적절 한 매개 변수 결정 됩니다, 단일 표준 이며 그래서 이러한 다른 설정의 몇 가지 경험적 테스트 하는 것은 필요. 각이 단계에 필요한 매개 변수를 설정 하려면 하나는 반복적으로 다른 매개 변수 집합을 입력 하 고 얼마나 잘 각 세트에서 얻은 결과 일치 하는지 몇 가지 대표적인 셀에서 수동 계산에서 확인 해야 합니다. 매개 변수 한 집합이 발견 되 면 그것은 다른 성장 조건과 유전적 배경에 불구 하 고 얻은 이미지의 대부분을 위해 사용할 수 있습니다.
또한, 하나는 smFISH 이미지의 최대 강도 투영 정량화22전에 수행할 수 있는 경우 테스트할 수 있습니다. 이 단계 자리 탐지 알고리즘을 단순화 하 고 크게 영상 시간, 비록 그들의 subcellular 지 방화 등 개별 관광 명소에 대 한 일부 잠재적으로 유용한 정보 비용 감소. 우리의 경우, NDC80 유전자에 의해 생산 하는 mRNA 분자의 수가 이었다 충분히 낮은 반점 (드문 일 신진 성적 증명서3,7효 모에 대 한)이이 처리 후 잘 분리 되었다. Colocalization 분석 중요 한 경우에 분석 파이프라인 각 smFISH 자리 colocalization를 평가 하기 위해 각 채널에서의 위치를 결정 해야 합니다. 특정 질문에 따라 질문 하 고, 각 명소의 강도 등 다른 정보 또한 추가 분석을 위해 파이프라인에서 압축을 풀 게 할 수 있습니다. 프로토콜에 단계는 키를 최적화와 이미지 분석 파이프라인 관심 질문 공부를 smFISH 데이터의 높은 품질을 얻기에서 결정적 이다.
The authors have nothing to disclose.
우리 앤 Dodson 감사와 스테파니 하인리히 smFISH 프로토콜을 최적화 하는 방법에 대 한 조언 위한 Xavier Darzacq 분석 플랫폼, Haiyan 황 통계 분석에 대 한 제안에 대 한 도움말. 이 작품은 십 센트의 3 월 (5-FY15-99), 퓨 자선 트러스트 (00027344), Damon Runyon 암 연구 재단 (35-15) 및 글렌 EÜ을 재단과 NSF 대학원 연구 장학금 부여 번호에서 자금에 의해 지원 되었다 JC에 DGE-1106400입니다.
BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |