Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Summary

Descrito é uma metodologia para quantificar a expressão dos 96 genes e 18 proteínas de superfície por células únicas ex vivo, permitindo a identificação de diferencialmente expressaram genes e proteínas em células infectadas por vírus em relação as células não infectadas. Aplicamos a abordagem de estudo CD4 infectadas SIV⁺ T células isoladas de macacos rhesus.

Abstract

Análise de célula única é uma ferramenta importante para dissecar heterogêneas populações de células. A identificação e isolamento de células raras podem ser difícil. Para superar este desafio, combinando uma metodologia indexados citometria de fluxo e elevado-throughput multiplexado quantitativa cadeia da polimerase (qPCR) foi desenvolvido. O objetivo foi identificar e caracterizar o vírus da imunodeficiência símia (SIV)-infectados células presentes dentro macaques do rhesus. Através da quantificação da proteína classificando fluorescência-ativado da pilha (FACS) e mRNA por qPCR, células infectadas por vírus são identificadas pela expressão do gene viral, que é combinada com medidas de gene e proteína de anfitrião para criar um perfil multidimensional . Chamamos a abordagem, avaliação de célula única Proteo-transcriptional alvo ou tSCEPTRE. Para executar o método, células viáveis estão manchadas com anticorpos fluorescentes específicas para marcadores de superfície utilizados para isolamento de FACS de um subconjunto de células e/ou análise fenotípica a jusante. Células individuais são classificadas seguido de Lise imediata, multiplex transcrição reversa (RT), pré-amplificação por PCR e qPCR alto throughput de até 96 transcrições. Medições de FACS são registradas no momento da triagem e posteriormente relacionadas com os dados de expressão do gene por posição bem para criar uma proteína combinada e perfil transcricional. Para estudar infectados com SIV diretamente células ex vivo, as células foram identificadas por qPCR detecção de múltiplas espécies de RNA virais. A combinação de transcrição viral e a quantidade de cada fornecem uma estrutura para classificar as células em estágios diferentes do ciclo de vida viral (por exemplo, produtivo versus não-produtivos). Além disso, tSCEPTRE de células SIV⁺ foram em relação ao não infectados células isoladas do mesmo espécime para avaliar genes diferencialmente expressos anfitrião e proteínas. A análise revelou anteriormente apreciada heterogeneidade de expressão do RNA viral entre células infectadas, assim como na vivo mediada por SIV pós-transcricional gene regulamento com resolução de célula única. O método tSCEPTRE é relevante para a análise de qualquer população de célula passível de identificação pela expressão da proteína de superfície marker(s), host ou patógeno genes ou suas combinações.

Introduction

Muitos patógenos intracelulares contam com máquinas de célula de acolhimento para replicar, muitas vezes alterando a biologia de pilha de anfitrião ou direcionamento especifico subpopulações de células hospedeiras para maximizar suas chances de propagação. Como resultado, processos biológicos células comumente são rompidos, com consequências deletérias para a saúde geral do hospedeiro. Compreender as interações entre os vírus e as células hospedeiras, na qual eles replicar irá elucidar mecanismos de doença que podem auxiliar no desenvolvimento de terapias melhoradas e estratégias para prevenir a infecção. Diretas ferramentas analíticas que permitem o estudo das interações patógeno-hospedeiro são essenciais para este fim. Análise de célula única fornece os meios apenas atribuem inequivocamente um fenótipo celular a um determinado genótipo ou infecção status¹. Por exemplo, infecções patogênicas frequentemente induzem alterações directas e indirectas em células hospedeiras. Por conseguinte, distinguir células infectadas de seus homólogos não infectados é necessário atributo anfitrião célula alterações ou infecção direta ou efeitos secundários, tais como generalizada inflamação. Além disso, para muitos patógenos, como SIV e vírus de imunodeficiência humana (HIV), infecção de célula de acolhimento prossegue através de múltiplos estágios, tais como cedo, tarde, ou latente, cada uma delas pode ser caracterizada por gene distinto e de perfis de expressão da proteína^{2 , 3 , 4 , 5}. as análises em massa das misturas de célula irão falhar capturar esta heterogeneidade⁶. Por outro lado, altamente multiplexado análises de célula única capazes de quantificar a expressão dos dois viral e genes de host oferecem um meio para resolver perturbações celulares específicos de infecção, incluindo variações em fases de infecção. Além disso, analisando interações patógeno-hospedeiro em fisiologicamente configurações relevantes é fundamental para a identificação dos eventos que ocorrem em organismos infectados. Assim, processos de métodos que podem ser aplicados diretamente ex vivo são susceptíveis de melhor captura na vivo .

SIV e HIV CD4-alvo⁺ T células, no qual eles neutralizar fatores do hospedeiro antiviral “restrição” e downregulate apresentadoras de moléculas para estabelecer infecção produtiva e evitar a vigilância imune^{7,8, 9,10,11}. Sem tratamento, a infecção resulta em enormes perdas de CD4⁺ T células, em última análise, culminando na adquirida da imunodeficiência síndrome (AIDS)¹². No cenário da terapia anti-retroviral, reservatórios de células Latentemente infectadas persistirem por décadas, colocando uma barreira formidável para estratégias curativas. Compreender as propriedades na vivo de células infectadas pelo VIH/SIV tem potencial para revelar características de célula de acolhimento fundamental na patogênese e persistência. No entanto, isto tem sido altamente desafiador, principalmente devido a low frequency de células infectadas e falta de reagentes prontamente reconhecê-los. Células que transcrevem RNA viral, estima-se que para estar presente no 1 – 0,01% de CD4⁺ T células no sangue e tecido linfoide^13,14,15. Sob terapia supressiva, células Latentemente infectadas são ainda menos frequentes em 10^-3– 10^{-7 16,17,18}. Coloração da proteína viral ensaios que funcionam bem para estudar em vitro infecções, tais como para Gag intracelular, são suboptimal devido a coloração de fundo de 0.01-0.1%, similar ou maior do que a frequência de células infectadas^{13, 14}. Coloração da superfície para proteína Env usando bem caracterizadas SIV/HIV Env específicas os anticorpos monoclonais também provou ser difícil, provavelmente por razões semelhantes. Recentemente, novas ferramentas que visam melhorar a detecção de células expressando mordaça por qualquer incorporando os ensaios específicos para mordaça RNA ou usando tecnologias alternativas de imagem^14,15,19. No entanto, essas abordagens permanecem limitadas no número de medições quantitativas executadas em cada célula.

Aqui, descrevemos a metodologia que (1) identifica células infectadas por vírus única diretamente ex vivo por qPCR quantitativo sensível e específica do gene viral e (2) quantifica a expressão de proteínas de superfície até 18 e 96 genes para cada infectado (e célula não infectada). Esta metodologia combina a medição da proteína de superfície de célula única por FACS seguido de lise celular imediata e expressão de gene análise usando multiplexado qPCR alvo no sistema Biomark. A tecnologia de circuito integrado de fluídico (IFC) permite a quantificação multiplexada de 96 genes de 96 amostras simultaneamente, realizado por uma matriz de 9.216 câmaras em que são realizadas as reações individuais qPCR. A classificação de células vivas FACS registra medições de abundância de alto teor de proteína, enquanto preservar a transcriptoma inteira para análise realizada imediatamente a jusante. Para identificar as células infectadas por vírus, ensaios específicos para RNAs virais alternativamente emendados e unspliced (vRNA) estão incluídos na análise qPCR, juntamente com um painel de ensaios definidos pelo usuário, totalizando até 96 genes, o número máximo de ensaios atualmente acomodadas em a IFC. A expressão de gene e proteína informações coletadas para cada célula são ligados por posição bem. Anteriormente, informou²⁰resultados desta análise em outro lugar. Aqui, nós fornecemos mais detalhadas orientações metodológicas, bem como mais descritiva fenotipagem de CD4 infectadas SIV⁺ T células.

Esta abordagem, que nós chamamos de tSCEPTRE, pode ser aplicada para as suspensões de qualquer população de célula viável reativa para anticorpos fluorescente etiquetados e expressando um transcriptome compatível com ensaios de qPCR disponível. Por exemplo, ele pode ser usado para caracterizar gene diferencial e expressão de proteínas em raras células ou células não facilmente distinguidas por marcadores de proteína. A preparação da amostra se baseia em um padrão que mancha o protocolo usando anticorpos comercialmente disponíveis. Cytometers com capacidade de classificação de célula única também estão disponíveis comercialmente, mas precauções de biossegurança adicionais são necessárias para o processamento de células vivas infecciosas. Gravar o perfil de expressão de proteínas de célula única – para cada célula pela posição bem, referida aqui como indexados a classificação, é uma característica comum de FACS comercialmente disponível software de classificação. Análise computacional de genes diferencialmente expressos anfitrião entre populações de células de interesse não é descrito aqui, mas as referências são fornecidas métodos publicados anteriormente.

Protocol

Nota: Um esquema de fluxo de trabalho do protocolo é mostrado na Figura 1. Consiste em três etapas principais: FACS, RT e pré-amplificação do cDNA e qPCR para até 96 genes simultaneamente. Duas versões do protocolo, classificação de células em limitar as diluições e classificação células únicas, são descritas mais detalhadamente nas etapas 5 e 6, respectivamente. Estas estratégias abordar questões de investigação diferentes, mas seguem procedimentos semelhantes. <p c…

Representative Results

O fluxo de trabalho para o protocolo inteiro é representado na Figura 1. Consiste em duas variações definidas pelo número de células ordenadas: qualquer diluição limitante ou como único células, conforme descrito no texto. Exemplos de análises de qualificação da primeira demão-sonda em 2 vezes diluições em série do RNA são mostrados na Figura 2. A estratégia associada para identificar potenciais células SIV<sup…

Discussion

O protocolo descrito aqui, denominado tSCEPTRE, integra a quantificação da proteína de superfície de célula única por citometria de fluxo multiparâmetros com expressão de RNAm de célula única quantitativa por RT-qPCR altamente multiplexado. A União dessas duas tecnologias permite snapshots de alto teor do combinado transcriptional e perfil de proteína de células individuais em um formato de alta produtividade. Usamos o método para identificar células até então indescritíveis infectadas com SIV na vi…

Materials

RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD