MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから
Summary
96 遺伝子の発現を量的に方法論が説明し、単一セルがex vivo、差動の同定を可能にする 18 の表面タンパク質は感染していない細胞を基準にしてウイルスに感染した細胞の遺伝子そして蛋白質を表明しました。+ T 研究 SIV 感染 CD4 にアプローチを適用アカゲザルから分離した細胞。
Abstract
単一細胞解析は、細胞の異種個体集団を解剖するための重要なツールです。同定や希少細胞の分離は困難することができます。このような課題を克服するためにインデックス付き cytometry 流れの手法の組み合わせと高スループット多重量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を開発しました。目的は、識別し、特徴付けるサル免疫不全ウイルス (SIV)-感染細胞アカゲザル内に存在します。多次元のプロファイルを作成するホスト遺伝子および蛋白測定と組み合わせてウイルスの遺伝子によって識別がウイルス感染細胞表面タンパク質蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えると qPCR による mRNA の定量を.アプローチ、対象の単一細胞タンパク質転写評価または tSCEPTRE と呼びます。メソッドを実行するには、実行可能なセルは細胞サブセットおよび/または下流の表現型解析の FACS 分離に使用される表面マーカーの特定蛍光抗体で染色が。単一のセルは即時換散、多重の逆のトランスクリプション (RT)、pcr 前、最大 96 の転写産物の高スループット qPCR の順で並べ替えられます。FACS 測定選別の時に記録、その後結合蛋白質と転写プロファイルを作成するよく位置によって遺伝子発現データにリンクします。Ex vivoセル直接 SIV 感染を研究するのには、セルが複数のウイルス RNA 種の qPCR の検出によって識別されました。それぞれの量とウイルスの転写産物の組み合わせ (例えば、非生産性対生産的な) ウイルスのライフ サイクルの異なる段階に細胞を分類するためのフレームワークを提供します。また、SIV+細胞の tSCEPTRE に比べて感染していない細胞発現宿主遺伝子とタンパク質を評価する同じ標本から分離したしていた。分析では、感染細胞だけでなく体内の SIV を介した転写後遺伝子発現制御単一セルの解像度の以前功績のウイルス RNA 式異質性を明らかにしました。TSCEPTRE メソッドは表面蛋白質のマーカー、ホストまたは病原体の遺伝子、またはこれらの組み合わせの式による識別に従う任意のセルの人口の分析のため。
Introduction
多くの細胞内の病原体は頻繁にホスト細胞生物学を変更すること、または伝播の彼らのチャンスを最大化するために宿主細胞の非常に特定の集団を対象と、レプリケートする宿主の細胞機構に依存します。その結果、細胞生物学的プロセスがホストの全体的な健康に有害な影響をよく破壊され。ウイルス、複製する、ホスト細胞間の相互作用を理解することは感染を防ぐために改良された治療法と戦略の開発に役立つ可能性があります病気のメカニズムを解明します。宿主-病原体相互作用の研究を可能にする直接の分析ツールこの年末に向けて不可欠です。単一細胞解析は、明確に特定の遺伝子または感染状態1に細胞の表現型を属性する唯一の手段を提供します。たとえば、病原性感染症はよくホスト細胞の直接と間接の両方の変化を誘発します。したがって、よう一般化感染していない相手からの感染細胞は直接感染する二次的影響属性ホスト セルの変更に必要な区別する炎症。また、SIV とヒト免疫不全ウイルス (HIV) のような多くの病原体を早く、遅く、ホスト細胞への感染のように複数の段階を進行または潜在的なそれぞれの特徴付けることができる個別の遺伝子、タンパク質発現プロファイル2で,3,4,5. 細胞の混合物の分析がこの不均質性6をキャプチャに失敗します。対照的に、両方のウイルスの発現を定量化することができる単一細胞解析の高多重し、宿主遺伝子が感染の段階でバリエーションを含む感染特異的細胞摂動を解決する手段を提供します。さらに、ホスト病原体の相互作用を生理学的分析関連する設定は、感染した生物で発生するイベントを識別するために重要です。したがって前のヴィヴォ、生体内で最高の可能性が高いキャプチャ直接適用できるメソッドを処理します。
SIV と HIV は、CD4 をターゲット+ T 細胞レセプターの抗原提示分子感染を確立し、免疫監視7、8を避けるためとホスト抗ウイルス「制限」の要因に対抗します。 9,10,11。治療せずに、感染は CD4 の大規模な損失の結果最終的に+ T 細胞免疫不全症候群 (AIDS)12を取得で最高潮に達する。抗レトロ ウイルス療法の設定、潜伏感染細胞の貯蔵所は、何十年も治療戦略に手強い障壁をポーズ保持されます。SIV 感染細胞の生体内での特性を理解病因と永続化に尽力のホスト細胞機能を明らかにする可能性があります。ただし、これは非常に挑戦して、感染した細胞のユーザヘとそれらを簡単に識別することができる試薬の不足のために主に。ウイルスの RNA を転写細胞は 0.01-1 に存在すると推定される CD4 の %+ T 細胞血液とリンパ組織13,14,15。抑制療法下で潜伏感染細胞は 10-3– 10-7 16,17,18より頻繁に。体外感染細胞内のギャグなどを学ぶためによく働く、背景は 0.01-0.1 染色による最適な試金のウイルス蛋白質の汚損 %、感染細胞13、周波数以上のよう 14。よ特徴付けられた SIV/HIV Env-特異的モノクローナル抗体を使用して Env 蛋白質の表面の汚損は、おそらく同様の理由から困難であること実証されています。最近では、新規ツールをいずれかでギャグを発現する細胞の検出率の向上目指すギャグ RNA または代替イメージング技術14,15,19を使用して特定の試金を組み込みます。しかし、このようなアプローチは限られている残る量的測定値の数で各セルに対して実行されます。
ここでは、(1)前のヴィヴォ特異的かつ高感度のウイルス遺伝子定量 qPCR、(2) 感染ごとに最大 18 の表面タンパク質および 96 の遺伝子の発現を定量化直接単一のウイルスに感染した細胞を識別する方法論について述べる (感染していない) のセルです。この方法論を組み合わせた即時セル換散によって続いて FACS による単一細胞表面タンパク質測定および Biomark システムにターゲットを絞った qPCR を多重遺伝子発現解析を使用しています。集積流体回路 (IFC) 技術は、9,216 室個別 qPCR 反応が実行されますのマトリックスによって達成、96 のサンプルから 96 遺伝子の多重化の定量を同時にできます。すぐに実行全体のトランスクリプトーム解析を維持しながら高蛋白質豊富な測定を記録ライブ セル FACS 並べ替え下流。ウイルスに感染した細胞を識別するための代わりにスプライシングと, ウイルス Rna (vRNA) 特定のアッセイまで 96 遺伝子で現在収容される試金の最大数の合計ユーザー定義アッセイのパネルと一緒に、qPCR 解析に含まれています。IFC。遺伝子発現とタンパク質情報を各セルには、よく位置によってリンクされています。我々 は以前20をこの分析結果を報告しました。ここで、SIV に感染した CD4 のさらにわかりやすい表現と同様に、方法論のガイドラインの詳細を提供+ T 細胞。
TSCEPTRE 長期的なこのアプローチは、蛍光に分類された抗体とトランスクリプトーム利用 qPCR アッセイと互換性を表現に反応の任意の実行可能なセル人口の懸濁液に適用できます。たとえば、差動遺伝子と希少な細胞または細胞表面蛋白質のマーカーによって簡単に区別の蛋白質の表現の特性評価に使用できます。サンプル調製は、市販の抗体を用いてのプロトコルを汚す標準に依存します。単一セルの並べ替え機能を備えた Cytometers も、市販されているが、追加安全予防策が感染細胞を処理するため必要。称するよく位置によって各セルの単細胞タンパク質の発現プロファイルを記録の並べ替え、インデックスとしては市販 FACS 選別ソフトウェアの一般的な機能です。興味の細胞集団間発現宿主遺伝子の解析はここでは、説明しませんが、参照は、以前に発行されたメソッドに提供されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルは、ここで説明、tSCEPTRE と呼ばれる、高多重 RT qPCR による単一細胞 mRNA の発現を定量的に多項目フローサイトメトリーによる単一細胞表面タンパク質定量を統合します。これら 2 つのテクノロジの連合有効高コンテンツ スナップショットを組み合わせて転写および高スループット形式で単一のセルの蛋白質のプロファイルにします。我々 はこれまでとらえどころのない細胞を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は NIAID VRC 流れ Cytometry コアと FACS 器具及び分別装置のメンテナンスおよび操作のための MHRP 流れ Cytometry 中核施設を感謝したいです。マリア ・ モンテロ、Vishakha シャルマ、開明歌の専門テクニカル サポート;マイケル ・ Piatak ・ ジュニア (故人) については SIV の qPCR の試金のデザイン。ブランドン メルディと SIV のマシュー Scarlotta 分離シーケンス。見解はこれらの者、米国陸軍や国防総省の位置を表す解釈すべきではないです。研究動物福祉法その他の連邦法と動物に関する規制に準拠して AAALAC 認定施設における動物の使用を承認されたプロトコルの下で実施された実験含む動物と原則を遵守してケアと NRC 文書実験動物使用の 2011 年版のためのガイドに記載されています。
Materials
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RNA extraction and PCR reagents and consumables |
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Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
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Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
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Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
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MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
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DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
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Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
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Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
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|
SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
|
Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
|
dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
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|
ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
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DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
|
RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
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TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
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CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
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TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
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|
Biomark reagents |
|||
|
Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
|
TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
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Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
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|
Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
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Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
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FACS reagents |
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SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
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CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
|
5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
|
Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
|
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
|
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
|
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
|
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
|
Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
|
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
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Instruments |
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BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
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BD FACS Aria |
BD Biosciences |
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|
ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
|
Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
|
IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
|
Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
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