Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden
Summary
Açıklanan 96 genlerin ifade quantitate için bir metodoloji olduğunu ve 18 yüzey proteinler tarafından tek hücreleri ex vivodifferentially tanımlanması için izin, genler ve proteinler kandan hücrelere göre virüs enfeksiyonlu hücrelerdeki dile getirdi. Yaklaşım+ T çalışma SIV-enfekte CD4 için uyguladığımız rhesus makak izole hücreler.
Abstract
Tek hücre Analizi hücre türdeş olmayan nüfus dissekan için önemli bir araçtır. Kimlik ve yalıtım nadir hücre-ebilmek var olmak zor. Bu zorluğu aşmak için bir metodoloji birleştirerek akış sitometresi dizine ve yüksek üretilen iş çoğaltılmış nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) geliştirilmiştir. Amaç tanımlamak ve maymun immün yetmezlik virüsü (SIV) karakterize oldu-enfekte hücreleri rhesus makak içinde mevcut. Nefelometri floresans aktif hücre (FACS) sıralama tarafından yüzey protein ve mRNA qPCR tarafından virüs bulaşan hücreleri çok boyutlu bir profil oluşturmak için ana bilgisayar gen ve protein ölçümleri ile kombine viral gen ekspresyonu tanımlanır . Biz yaklaşım, hedeflenen tek hücreli proteolitik-transkripsiyon değerlendirme veya tSCEPTRE vadeli. Yöntemi gerçekleştirmek için hücrelerin floresan antikor ile belirli bir hücre alt ve/veya aşağı akım fenotipik analiz FACS yalıtımı için kullanılan yüzey işaretleri lekeli. Tek hücreleri hemen lizis, multiplex ters Transkripsiyon (RT), PCR öncesi amplifikasyon ve yüksek işlem hacmi qPCR 96 tutanaklar, ardından sıralanır. FACS ölçümleri sıralama sırasında kaydedilir ve daha sonra gen ifadesi verileri bir kombine protein ve transkripsiyon profil oluşturmak için iyi konuma göre bağlı. SIV-enfekte çalışmaya doğrudan ex vivohücre, hücre birden çok viral RNA türler qPCR tespiti tarafından tespit edilmiştir. Viral transkript kombinasyonu ve miktar her sağlamak bir çerçeve içine viral ömrünün (Örneğin, karşı verimli verimli) farklı aşamalarında hücreleri sınıflandırma. Ayrıca, SIV+ hücre tSCEPTRE göre hastalık bulaşmamış tek hücreleri differentially ifade ana bilgisayar genler ve proteinler değerlendirmek için aynı örnek izole edildi. Analiz daha önce hesaba katılmayan viral RNA ifade heterojenite yanı sıra vivo SIV-aracılı çoğu gen düzenlemesi tek hücreli çözünürlük ile enfekte hücreleri arasında ortaya koydu. TSCEPTRE yöntemi herhangi bir hücre popülasyon yüzey protein marker(s), ana bilgisayar veya patojen gene(s) veya bunların kombinasyonları ifade tarafından kimliği için mükellef analizi için uygundur.
Introduction
Çok sayıda hücre içi patojenlerin çoğaltmak için konak hücre makine kez konak hücre biyolojisi değiştirme veya ana hücrelerinin yayılma şanslarını en üst düzeye çıkarmak için çok özel altgrupları hedefleme güveniyor. Sonuç olarak, hücre biyolojik süreçlerin yaygın olarak, ana bilgisayarın genel sağlık için zararlı sonuçları ile kesintiye. Virüsler ve içinde çoğalıyorlar konak hücreleri arasındaki etkileşimler anlama bulaşmayı önlemek amacıyla gelişmiş tedaviler ve stratejileri geliştirmede yardımcı olabilir hastalığı mekanizmaları aydınlatmak. Ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma sağlayan doğrudan analitik araçlar bu amaçla doğru gereklidir. Tek hücreli analiz tek belirsizliğe yer bırakmadan bir hücresel fenotip özniteliği bir belirli genotip ya da enfeksiyon durumu1için bulunmasını sağlar. Örneğin, patojenik enfeksiyonları sık konak hücreleri doğrudan ve dolaylı değişimler neden. Bu nedenle, ayrım bulaşmamış karşılıklarından enfekte hücreleri doğrudan enfeksiyon veya ikincil etkileri, öznitelik ana hücre değişiklikleri için gerekli gibi Genelleştirilmiş iltihabı. Ayrıca, SIV ve insan immün yetmezlik virüsler (HIV), gibi birçok patojenler için konak hücre enfeksiyon birden çok aşamalardan gibi gelirleri erken, geç, ya da gizli, her biri farklı gen ve protein ifade profilleri2 tarafından karakterize edilebilir , 3 , 4 , 5. hücre karışımları toplu analizleri bu heterojenlik6yakalamak başarısız olur. Aksine, son derece multiplexed tek hücreli analizleri viral her iki ifade ölçmek mümkün ve ana bilgisayar genler enfeksiyon etap üzerinden türevleriyle birlikte enfeksiyon özgü hücresel tedirginlikler gidermek için bir yol sunar. Ayrıca, ana bilgisayar-patojen etkileşimlerde fizyolojik açıdan analiz ilgili ayarları virüslü canlılar arasında meydana gelen olayları tanımlaması için kritik. Böylece, ex vivo çoğu doğrudan olasılığı en iyi yakalama vivo içinde uygulanacak yöntemleri işler.
SIV ve HIV hedef CD4+ T hücreleri, ana bilgisayar antiviral “kısıtlama” faktörler ve tümleyici antijen sunan molekül immün gözetim7,8, önlemek ve üretken enfeksiyon kurmak için hangi onlar karşı koymak 9,10,11. Tedavi olmadan, enfeksiyon sonuçları büyük CD4 kaybına+ T hücreleri, sonuçta sonuçlanan kazanılmış bağışıklık yetmezliği sendromu (AIDS)12. Antiretroviral tedavi ayarında gizlice enfekte hücre rezervuarlar iyileştirici stratejiler için zorlu bir engel poz yıllardır devam ediyor. Vivo HIV/SIV-enfekte hücre özellikleri’ni anlama ana bilgisayar ökaryotlar arasındaki farklılıklar patogenez ve sebat enstrümantal ortaya çıkarmak için potansiyele sahiptir. Ancak, bu son derece, öncelikle enfekte hücreleri low frequency ve onları kolayca tespit edebilmek reaktifler eksikliği nedeniyle zor oldu. Viral RNA, uyarlamak hücreleri 0,01-1’de bulunması için tahmin edilmektedir CD4%+ T hücreleri kan ve lenf dokusu13,14,15. Süpresif tedavi altında gizlice enfekte hücreleri 10-3–10-7 16,17,18, daha az sıktır. Viral protein boyama deneyleri içinde vitro enfeksiyonlar, tür hücre içi Gag, eğitim için iyi iş 0,01 – 0.1 arka plan boyama nedeniyle suboptimal %, benzer veya daha fazla enfekte hücreleri13, frekans 14. Yüzey boyama için iyi karakterize SIV/HIV Env özgü monoklonal antikorları kullanarak Env protein de büyük olasılıkla benzer nedenlerden dolayı zor olabilir kanıtlanmıştır. Son zamanlarda, Gag tarafından ifade hücre algılama geliştirmek için yeni araçlar amaç birleşmeyle deneyleri belirli gag RNA veya alternatif görüntüleme teknolojileri14,15,19. Ancak, bu tür yaklaşımlar sınırlı kalır nicel ölçümler sayısı içinde gerçekleştirilen her cep telefonundan.
Burada, biz (1) 18’e kadar yüzey proteinleri ve 96 genlerin ifadesi her bulaştırmak için ex vivo duyarlı ve spesifik viral gen nicel qPCR ve (2) tarafından quantifies doğrudan tek virüs bulaşan hücreleri tanımlayan yöntembilim tanımlamak (ve virüs bulaşmamış) hücre. Tek hücre yüzey proteini ölçüm hemen hücre lizis tarafından takip FACS tarafından Bu metodoloji birleştirir ve gen ifade analizi ile hedeflenen qPCR Biomark sistemdeki multiplexed. Entegre sıvı devre (IFC) teknoloji 96 örneklerinden 96 genlerin çoğaltılmış Nefelometri aynı anda, 9,216 odaları tek tek qPCR reaksiyonlar gerçekleştirildiği bir matris tarafından başarılı izin verir. Analiz için tüm transcriptome koruyarak hemen gerçekleştirilen iken canlı hücre FACS sıralama yüksek içerikli protein bereket ölçümleri kaydeder aşağı akım. Virüs bulaşan hücreleri tanımlamak için alternatif olarak spliced ve unspliced viral RNA’ların (vRNA) ilişkin deneyleri özel dahildir 96 genler, şu anda içinde ağırladı deneyleri sayısının Toplam Kullanıcı tanımlı deneyleri bir panel ile birlikte qPCR Analizi IFC. Gen ekspresyonu ve protein her hücre için toplanan bilgilerin iyi konuma göre bağlantılıdır. Biz daha önce başka bir yerde bu analiz sonuçları20bildirdi. Burada, daha ayrıntılı metodolojik yönergeleri yanı sıra daha da açıklayıcı fenotipleme SIV-enfekte CD4 sağlamak+ T hücreleri.
TSCEPTRE dönem, bu yaklaşım herhangi bir geçerli hücre popülasyon fluorescently etiketli antikorlar ve transcriptome temin qPCR deneyleri ile uyumlu ifade için reaktif süspansiyonlar uygulanabilir. Örneğin, farklı gen ve protein ifadede nadir hücreleri veya hücre yüzey proteini işaretleri tarafından kolayca ayırt karakterize için kullanılabilir. Numune hazırlama bir standart iletişim kuralı’nı piyasada bulunan antikor boyama dayanır. Cytometers tek hücreli sıralama yeteneği ile de ticari olarak kullanılabilir, ancak ek Biyogüvenlik önlemleri bulaşıcı canlı hücreleri işlemek için gereklidir. Tek – hücre protein ifade profil burada başvurulan her hücre iyi konuma göre kayıt sıralama, dizine gibi piyasada bulunan FACS yazılım sıralama ortak bir özelliği var. Sayısal Analiz differentially ifade ana bilgisayar genlerin hücre popülasyonlarının ilgi arasında burada açıklanmayan ancak başvurular için daha önce yayımlanmış yöntemleri sağlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol, burada açıklanan tSCEPTRE olarak adlandırdığı, multiparameter akış sitometresi ile nicel tek hücreli mRNA ifade son derece çoğaltılmış RT-qPCR tarafından tarafından tek hücre yüzey proteini Nefelometri bütünleştirir. Bu iki teknoloji Birliği yüksek içerikli anlık görüntülerini kombine transkripsiyon ve bir yüksek-den geçerek biçimde tek hücre proteini profili sağlar. Biz SIV vivo içindeile enfekte şimdiye kadar zor hücrelerini tanımlamak için yöntemini kullanın v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar NIAID VRC akış sitometresi çekirdek ve MHRP akış sitometresi çekirdek tesisleri bakım ve işletme FACS aletleri ve sıralama ekipman için teşekkür etmek istiyorum; Maria Montero, Vishakha Sharma, uzman teknik destek için Kaimei şarkı; Michael Piatak, Jr. (SIV qPCR tahlil tasarım; hakkında yardım almak için öldü) ve Brandon Keele ve Matthew Scarlotta SIV için dizileri izole etmek. Görüşler yazarlar vardır ve ABD Ordusu veya Savunma Bakanlığı’nın pozisyonlar temsil etmek üzere alınmamalıdır. Araştırma bir akredite AAALAC tesis hayvan refah Yasası ve diğer federal tüzük ve hayvanlara ilişkin düzenlemelere uygun olarak onaylanmış hayvan kullanım kuralında altında yapılmıştır ve içeren hayvan deneyleri ve politikalarına Bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının, NATO-Rusya Konseyi yayın, 2011 baskı için kılavuzdaki belirtti.
Materials
|
RNA extraction and PCR reagents and consumables |
|||
|
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
|
|
Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
|
|
Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
|
|
MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
|
|
DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
|
|
Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
|
|
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
|
|
SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
|
Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
|
dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
|
|
ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
|
|
DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
|
RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
|
|
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
|||
|
CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
|
|
TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
|
|
Biomark reagents |
|||
|
Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
|
TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
|
|
Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
|
|
Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
|
|
Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
|
|
FACS reagents |
|||
|
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
|
|
CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
|
5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
|
Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
|
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
|
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
|
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
|
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
|
Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
|
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
|
Instruments |
|||
|
BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
||
|
BD FACS Aria |
BD Biosciences |
||
|
ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
|
Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
|
IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
|
Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
- Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
- Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
- Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
- Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
- Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
- Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
- Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67 (2016).
- Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
- Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
- Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
- Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
- Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
- Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
- Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).
- Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
- Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
- DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
- Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).
- Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
- Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
- McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).
- McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
- Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
- Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
- Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
- Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
- Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
- Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).
- Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
- Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
- Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
- Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75 (2017).
