En forenklet og effektiv metode til at isolere primære humane keratinocytter fra voksen hudvæv
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at effektivt isolere primære humane keratinocytter fra voksen hud væv. Denne metode forenkler den konventionelle procedure ved hjælp af ROCK hæmmer Y-27632 på mellemlang og podning til spontant adskille epidermale celler fra dermal celler.
Abstract
Primære humane keratinocytter isoleret fra frisk hud væv og deres ekspansion i vitro har været udbredt, laboratorie-forskning og kliniske applikationer. Metoden konventionelle isolation af humane keratinocytter indebærer en totrinsprocedure for sekventielle Enzymatisk nedbrydning, som har vist sig for at være ineffektive i generere primærelementer fra voksent væv på grund af lav celle genfindingsprocenten og reduceret celle levedygtighed. Vi har for nylig rapporteret en avanceret metode til at isolere menneskelige primære epidermal stamceller fra væv, hud, der udnytter Rho kinase inhibitor Y-27632 på mellemlang. Sammenlignet med den traditionelle protokol, denne nye metode er enklere, lettere og mindre tidskrævende, og øger epitelial stamcelle udbytte og forbedrer deres stamcelle karakteristika. Desuden, den nye metode kræver ikke adskillelse af epidermis til dermis, og, derfor, er velegnet til isolering af celler fra forskellige typer af voksen væv. Denne nye isolation metode overvinder de store mangler ved konventionelle metoder og er mere egnet til at producere store mængder af epidermale celler med høj potens både laboratorium og kliniske applikationer. Her beskriver vi den nye metode i detaljer.
Introduction
Målet var at udvikle en enkel og effektiv protokol for at isolere primære humane keratinocytter (HKCs) fra voksne væv, især til kliniske applikationer. Huden epidermal stamceller, lokaliseret i den basale lag af huden, besidder et stort potentiale til at formere sig og differentiere og give keratinocytter for at opretholde funktionerne af huden1,2,3, 4. HKCs isoleret fra hud væv er almindeligt brugt til hud væv manipulation og regenerering formål, især i reparation af beskadiget hud og genterapi for kliniske applikationer5,6. Det centrale spørgsmål for HKC-baserede programmer er effektivt isolerer og udvide stort antal HKCs med høj potentiel in vitro-7,8. Selv om forskellige forskergrupper har udviklet metoder til at producere kulturer af stilk-lignende HKCs, er disse metoder undertiden tidskrævende og kompliceret at udføre og har andre begrænsninger, såsom lav celle udbytter og er begrænset af typen af huden modellen brugte9. For eksempel, indebærer den traditionelle metode til at isolere HKCs fra hud væv en to-trins Enzymatisk nedbrydning med en adskillelse af epidermis fra dermis6. Denne metode fungerer normalt godt for neonatal væv, men det bliver meget vanskeligt, når det bruges til at isolere celler fra voksne væv.
Y-27632, en hæmmer af Rho-forbundet protein kinase (ROCK), er blevet rapporteret til betydeligt øge effektiviteten af epidermale stamceller isoleret og koloni vækst10,11,12. I en tidligere undersøgelse opdagede vi at Y-27632 letter den klonede vækst af epidermale celler, men reducerer udbyttet af dermal celler af varierende kontrollerende udtryk for vedhæftning molekyler13. Vi har også etableret et nyt konditioneret podning medie, kaldet G-medium, som støtter vækst og udbytte af primære epidermale celler. Ved at kombinere G-medium med Y-27632, kan denne nye metode spontant adskille dermal og epidermal celler efter enzym fordøjelse, dermed fjerne trin i epidermis-dermis adskillelse13,14. Baseret på tidligere betænkninger, beskrive vi nu den detaljerede procedure af denne nye metode til at isolere HKCs fra voksen hudvæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kulturperler primære HKCs har været bredt udnyttet til at behandle sår i klinikker i mere end tre årtier, og siden tid, det har altid været vigtigt at effektivt opnå tilstrækkeligt antal celler til kliniske applikationer i tide. Metoden konventionelle isolation, der kræver adskillelse af epidermis til dermis, gør det derfor vanskeligt at opfylde disse krav, på grund af det lave udbytte af celler og den lave evne til passage voksne celler i praksis. Her, beskriver vi en ny enkel metode vi udviklede for at opnå …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den nationale nøgle forskning og udvikling Program af Kina (2017YFA0104604), General Program af National Natural Science Foundation of China (NSFC, 81772093), videnskab og teknologi udvikling Program af Suzhou (ZXL2015128), Natural Science Foundation of Jiangsu provins (BK20161241), og en Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells – role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
