Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.
Abstract
Primären menschlichen Keratinozyten aus frischem Hautgewebe und ihre Erweiterung in-vitro- isoliert haben für Laborforschung und klinische Anwendungen weit verbreitet. Die konventionelle Isolationsmethode der menschlichen Keratinozyten beinhaltet ein zweistufiges sequentielle enzymatische Verdauung Verfahren, die sich bewährt hat, als ineffizient bei der Schaffung von Primärzellen von adulten Geweben aufgrund der niedrigen Zelle Wiederfindungsrate und reduzierten Zelle Lebensfähigkeit. Wir berichteten vor kurzem eine fortgeschrittene Methode, menschliche primäre epidermaler Vorläuferzellen von Hautgewebe zu isolieren, die die Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 im Medium nutzt. Im Vergleich mit dem traditionellen Protokoll, diese neue Methode ist einfacher, leichter und weniger zeitaufwendig, und epithelialen Stammzellen Ausbeute erhöht und verbessert ihre Stammzell-Eigenschaften. Darüber hinaus der neuen Methodik erfordert nicht die Trennung der Epidermis von der Dermis, und eignet sich somit für die Isolierung von Zellen aus verschiedenen Arten von adulten Geweben. Diese neue Isolationsmethode überwindet die größten Schwächen der herkömmlichen Methoden und eignet sich eher für die Herstellung von großen Zahlen von epidermalen Zellen mit hoher Potenz für Labor und klinische Anwendungen. Hier beschreiben wir die neue Methode im Detail.
Introduction
Ziel war es, ein einfaches und effizientes Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten (HKCs) von adulten Geweben, vor allem für klinische Anwendungen isolieren zu entwickeln. Epidermalen Hautstammzellen, lokalisiert in der basalen Schicht der Haut, besitzen ein hohes Potenzial zu vermehren und zu unterscheiden und bieten Keratinozyten zur Aufrechterhaltung der Funktionen der Haut1,2,3, 4. HKCs von Geweben weit für Haut Gewebe-Engineering und Regeneration Zwecke, vor allem in der Reparatur der beschädigten Haut und in der Gentherapie für klinische Anwendungen5,6 verbreitet sindHaut isoliert. Die Schlüsselfrage für HKC-basierten Anwendungen ist es, effizient zu isolieren und zu große Anzahl von HKCs mit hohem Potenzial in-vitro-7,8zu erweitern. Obwohl verschiedene Forschergruppen Methoden entwickelt, um die Kulturen der Stamm-ähnliche HKCs zu produzieren, sind diese Methoden manchmal zeitaufwendig und kompliziert zu führen und andere Einschränkungen, z. B. niedrige Zelle Renditen und durch die Art der Haut Probe begrenzt 9verwendet. Zum Beispiel beinhaltet die traditionelle Methode, HKCs von Hautgewebe zu isolieren eine zweistufigen enzymatischen Verdauung mit einer Trennung der Epidermis von der Dermis-6. Diese Methode funktioniert in der Regel gut für neonatale Gewebe, aber es wird sehr schwierig, wenn verwendet, um Zellen aus adulten Geweben zu isolieren.
Y-27632, ein Inhibitor der Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK), wurde berichtet, erheblich verbessern die Effizienz der epidermalen Stammzellen isoliert und Kolonie Wachstum10,11,12. In einer früheren Studie entdeckten wir, dass Y-27632 das klonale Wachstum der Epidermiszellen erleichtert sondern den Ertrag der dermalen Zellen verringert durch die differentiell Steuerung des Ausdrucks der Adhäsion Moleküle13. Wir stellte auch ein neues konditionierten Inokulation Medium, genannt G-Medium, das Wachstum und Ertrag von primären epidermalen Zellen unterstützt. Durch die Kombination G-Medium mit Y-27632, kann diese neuartige Methode epidermale und dermale Zellen spontan nach Enzym Verdauung, so dass den Schritt der Epidermis-Dermis Trennung13,14trennen. Basierend auf früheren Berichten, beschreiben wir nun die Einzelheiten des Verfahrens der neuen Methode HKCs von Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kultivierte primäre HKCs haben häufig genutzt, um Wunden in Kliniken mehr als drei Jahrzehnte lang zu behandeln, und seit dieser Zeit wurde es immer wichtig, ausreichende Zahl von Zellen für klinische Anwendungen in einer fristgerechten Weise effizient zu erhalten. Daher erschwert in der Praxis, die herkömmliche Isolierung-Methode, die die Trennung der Epidermis von der Dermis erfordert, diese Anforderungen durch die geringe Ausbeute an Zellen und die geringe Fähigkeit, adulte Zellen die passage. Hier beschreiben wi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), das allgemeine Programm der National Natural Science Foundation of China (NSFC, 81772093), der Wissenschaft und Technologie Entwicklung Programm von Suzhou (ZXL2015128), der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20161241), und ein Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
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