Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани
Summary
Здесь мы представляем протокол эффективно изолировать первичной человеческие кератиноциты от взрослых кожных тканей. Этот метод упрощает обычные процедуры с использованием ингибитора Y-27632 рок в средне-прививка спонтанно отделить эпидермальных клеток от кожных клеток.
Abstract
Для лабораторных исследований и клинического применения основного человека кератиноцитов, изолированный от свежих кожных тканей и их расширение в пробирке широко использовались. Обычные изоляции метод человеческие кератиноциты включает в себя последовательное ферментативного пищеварения двухэтапная процедура, которая оказалась неэффективной в генерации начальных клетки от взрослых тканей из-за низкой сотовый скорость восстановления и сокращение клеток жизнеспособности. Недавно мы сообщили расширенный метод изолировать человека первичной эпидермальный прародитель клеток тканей кожи, использующий ингибитора киназы Ро Y-27632 в среде. По сравнению с традиционными протоколом, этот новый метод проще, легче и менее трудоемким и увеличивает урожайность эпителиальных стволовых клеток и усиливает их характеристики стволовых клеток. Кроме того новая методология не требует отделения эпидермис от дермы и, таким образом, подходит для изоляции клетки из различных видов тканей взрослого. Этот новый метод изоляции преодолевает основных недостатков традиционных методов и больше подходит для производства большого количества клеток эпидермиса с высокой потенции, как в лабораторных, так и для клинического применения. Здесь мы опишем новый метод в деталях.
Introduction
Целью было разработать простой и эффективный протокол изолировать первичной человеческие кератиноциты (HKCs) от взрослых тканях, особенно для клинического применения. Эпидермальный стволовых клеток кожи, локализованные в базального слоя кожи, обладают высоким потенциалом размножаться и дифференциации кератиноцитов для поддержания функций кожи1,2,3, 4. HKCs, изолированных от кожи, ткани широко используются для кожи ткани инженерии и регенерации целей, особенно в ремонт поврежденной кожи и генной терапии для клинического применения5,6. Ключевым вопросом для приложений на базе HKC является эффективно изолировать и расширить большое количество HKCs с высоким потенциальным в vitro7,8. Хотя различные исследовательские группы разработали методы для производства культур стволовых как HKCs, эти методы являются иногда длительным и сложным для выполнения и другие ограничения, например урожайность низкая клеток и ограничиваясь типом кожи образца используемые9. К примеру традиционный метод, чтобы изолировать HKCs от кожных тканей предполагает двухэтапный ферментативного пищеварения с разделением эпидермис дерма6. Этот метод обычно хорошо работает для новорожденных тканей, но она становится очень трудно, когда используется для изоляции клетки от взрослых тканях.
Y-27632, ингибитора киназы Ро связанные белком (рок), сообщалось значительно повысить эффективность эпидермальный стволовых клеток изоляции и колонии роста10,11,12. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что Y-27632 облегчает клоновых рост клеток эпидермиса, но уменьшает доходность кожных клеток, дифференциально контролируя экспрессию молекул адгезии13. Мы также создали новое средство кондиционером прививка, называется G-средний, который поддерживает рост и урожайность первичных клеток эпидермиса. Объединив G-средний с Y-27632, этот новый метод может спонтанно отдельных клеток эпидермиса и дермы после Пищеварение энзима, удалив таким образом шаг эпидермис дерма разделения13,14. Основываясь на предыдущих докладах, мы теперь описывают подробные процедуры этот новый метод, чтобы изолировать HKCs от взрослых кожной ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Культивированный первичной HKCs широко использовались для лечения ран в клиниках для более чем трех десятилетий, и с того времени, он был всегда важно эффективно получить достаточное количество клеток для клинического применения своевременно. Таким образом на практике, обычные изоляци?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальной ключ научных исследований и развития программа Китая (2017YFA0104604), Генеральный программы национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 81772093), Наука и технологии развития программа Сучжоу (ZXL2015128), Естественные науки фонд провинции Цзянсу (BK20161241) и премию ученый Taishan Шаньдун (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells – role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
