Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta
Summary
Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.
Abstract
Keratinocytes umani primari isolato dai tessuti di pelle fresca e loro espansione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per ricerche di laboratorio e per applicazioni cliniche. Il metodo di isolamento convenzionale di cheratinociti umani comporta una procedura di digestione enzimatica sequenziale in due fasi, che ha dimostrata di essere inefficiente nel generare cellule primarie da tessuti adulti a causa del tasso di recupero cellulare basso e riduttrice delle cellule vitalità. Recentemente abbiamo segnalato un metodo avanzato per isolare le cellule progenitrici epidermica primaria umana dai tessuti della pelle che utilizza l’inibitore della chinasi Rho Y-27632 nel mezzo. Confrontato con il protocollo tradizionale, questo nuovo metodo è più semplice, più facile e meno dispendio di tempo e aumenta il rendimento delle cellule staminali epiteliali e migliora le caratteristiche di cellule staminali. Inoltre, la nuova metodologia non richiede la separazione dell’epidermide dal derma e, di conseguenza, è adatta per isolare le cellule da diversi tipi di tessuti dell’adulto. Questo nuovo metodo di isolamento supera le carenze principali dei metodi convenzionali ed è più adatto a produrre un numero elevato di cellule epidermiche con elevata potenza per laboratorio e per applicazioni cliniche. Qui, descriviamo il nuovo metodo in dettaglio.
Introduction
L’obiettivo era quello di sviluppare un protocollo semplice ed efficace per isolare i keratinocytes umani primari (HKCs) da tessuti adulti, soprattutto per applicazioni cliniche. Cellule staminali epidermiche cutanee, localizzate nello strato basale della pelle, possiedono un alto potenziale di proliferare e differenziare e fornire cheratinociti per mantenere le funzioni della pelle1,2,3, 4. HKCs isolato dalla pelle tessuti sono ampiamente utilizzati per pelle tessuto ingegneria e rigenerazione scopi, soprattutto nella riparazione della pelle danneggiata e nella terapia genica per applicazioni cliniche5,6. La questione chiave per le applicazioni basate su HKC è efficacemente isolare ed espandere i grandi numeri di HKCs con alto potenziale in vitro7,8. Anche se vari gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per produrre colture di staminali-simili HKCs, questi metodi sono a volte lungo e complicato per eseguire ed avere altre limitazioni, come cella bassa resa ed essere limitato dal tipo di esemplare della pelle usato9. Per esempio, il metodo tradizionale per isolare HKCs dai tessuti della pelle comporta una digestione enzimatica in due fasi con una separazione dell’epidermide dal derma6. Tale metodo di solito funziona bene per tessuti neonatale, ma diventa molto difficile quando utilizzato per isolare le cellule da tessuti adulti.
Y-27632, un inibitore della chinasi di proteina Rho-collegata (ROCK), è stato segnalato per migliorare significativamente l’efficienza della cellula staminale epidermica isolamento e Colonia crescita10,11,12. In uno studio precedente, abbiamo scoperto che Y-27632 facilita la crescita clonale delle cellule epidermiche, ma riduce il rendimento delle cellule dermiche differenzialmente controllando l’espressione di molecole di adesione13. Inoltre abbiamo stabilito un nuovo medium condizionato di inoculazione, chiamato G-medio, che sostiene la crescita e la resa delle cellule epidermiche primarie. Dalla combinazione di G-medio con Y-27632, questo metodo novello può separare spontaneamente le cellule epidermiche e cutanee dopo digestione degli enzimi, eliminando in tal modo il passaggio di epidermide-derma separazione13,14. Basato su rapporti precedenti, ora descriviamo la procedura dettagliata di questo nuovo metodo per isolare HKCs dal tessuto pelle adulta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Colta HKCs primario sono stati ampiamente utilizzati per curare le ferite in cliniche per più di tre decenni e, da quel momento, è stato sempre importante ottenere in modo efficiente un numero sufficiente di cellule per applicazioni cliniche in modo tempestivo. Quindi, in pratica, il metodo di isolamento convenzionale, che richiede la separazione dell’epidermide dal derma, rende difficile soddisfare queste esigenze, a causa della bassa resa delle cellule e la bassa capacità di passaggio di cellule adulte. Qui, descriv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (2017YFA0104604), il programma generale della Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (NSFC, 81772093), la scienza e la tecnologia di sviluppo programma di Suzhou (ZXL2015128), la Fondazione con scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20161241) e un Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
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