इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल है कि तकनीकी पहलुओं और आवश्यक आवश्यकताओं विवरण के लिए पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) के साथ रोगियों में मजबूत ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए, पर यूरोपीय अनुसंधान पहल के संचित अनुभव के आधार पर पेश CLL (एरिक) ।
बी सेल परिपक्वता के दौरान, immunoglobulin की जटिल प्रक्रिया (़) जीन वी (घ) जे पुनर्संयोजन दैहिक hypermutation के साथ युग्मित (SHM) प्रत्येक व्यक्ति बी सेल के भीतर एक अनूठा डीएनए अनुक्रम को जन्म देता है । एक एकल कोशिका के क्लोनल विस्तार से बी सेल द्रोह परिणाम के बाद से, ़ जीन एक अद्वितीय आणविक एक व्यक्तिगत रोगी के भीतर सभी घातक कोशिकाओं के लिए आम हस्ताक्षर का प्रतिनिधित्व; इस प्रकार, ़ जीन पुनर्व्यवस्थाओं क्लोनिंग मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक महत्वपूर्ण क्लोनर पहचानकर्ता के रूप में सेवारत होने के अलावा, ़ जीन अनुक्रम एक ‘ आणविक समयरेखा ‘ के रूप में कार्य कर सकते हैं क्योंकि यह विशिष्ट विकास के चरणों के साथ जुड़ा हुआ है और इसलिए नवोत्पादित परिवर्तन में शामिल बी सेल के इतिहास को दर्शाता है । इसके अलावा, विशेष रूप से जीर्ण लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) में कुछ दुष्टों के लिए, ़ जीन अनुक्रम शकुन और संभावित पूर्वानुमान क्षमताओं रखती है । उस ने कहा, extrapolating ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण से सार्थक निष्कर्ष अगर मजबूत तरीकों और उपकरणों के लिए उनके विश्लेषण में सहायता उपलब्ध नहीं थे असंभव होगा । यह लेख, CLL (एरिक) पर यूरोपीय अनुसंधान पहल के विशाल अनुभव पर ड्राइंग, विवरण तकनीकी पहलुओं और आवश्यक आवश्यकताओं को सुनिश्चित करने के लिए विश्वसनीय और reproducible ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण CLL में, एक परीक्षण है कि अब की सिफारिश की है उपचार से पूर्व सभी CLL रोगियों के लिए । अधिक विशेष रूप से, विभिंन विश्लेषणात्मक चरणों clonotypic ़ जीन पुनर्व्यवस्था की पहचान और न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के निर्धारण के आइजी जीन अनुक्रम डेटा की सटीक नैदानिक व्याख्या को लेकर वर्णित हैं ।
क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL), पश्चिमी देशों में वयस्कों में ल्यूकेमिया का सबसे आम रूप, परिपक्व नवोत्पादित बी कोशिकाओं के क्लोनल विस्तार की विशेषता है1. एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य से, रोग पाठ्यक्रम कुछ रोगियों को एक आक्रामक बीमारी का अनुभव के साथ अत्यंत परिवर्तनशील है, निदान के बाद बहुत जल्दी इलाज की आवश्यकता होती है, और अक्सर relaps या चिकित्सा के लिए किया जा रहा है । यह रोगियों का एक पर्याप्त अनुपात (~ 30%), जो एक indolent रोग के साथ मौजूद है, उपचार की आवश्यकता नहीं है, और एक जीवन प्रत्याशा स्वस्थ उंर के समान है-मिलान व्यक्तियों2के लिए इसके विपरीत में है । इस नैदानिक विविधता CLL रोगियों में पाया आणविक विषमताओं की विविधता में परिलक्षित होता है जो अंततः इस रोग की रोगजनन और प्रगति ड्राइव3.
एक सटीक CLL निदान की स्थापना आमतौर पर सीधा है, तथापि, aforementioned नैदानिक विविधता CLL रोगियों के प्रभावी प्रबंधन में बाधा और शकुन और भविष्यवाणी मार्करों कि में सहायता कर सकता है के लिए की जरूरत को रेखांकित कर सकते है उपचार निर्णय लेने2. कई अध्ययनों से CLL के शकुन को परिष्कृत करने का प्रयास किया है, उपंयास नैदानिक और जैविक मार्कर के एक बहुतायत में समापन4प्रस्तावित किया जा रहा है । clonotypic immunoglobulin भारी चर (IGHV) जीन के उत्परिवर्तन की स्थिति CLL में सबसे मजबूत शकुन मार्करों में से एक है, मोटे तौर पर इस तथ्य के कारण है कि (i) यह समय के साथ स्थिर रहता है और के रूप में रोग की प्रगति, और (ii) यह स्वतंत्र है अंय नैदानिक और जैविक मानकों5. के बावजूद, बहुत कुछ है, अगर IGHV उत्परिवर्तन स्थिति सहित किसी भी मार्कर, वर्तमान में नैदानिक दिनचर्या में लागू कर रहे है निदान के समय ।
CLL की तारीख में ़ जीन अनुक्रमण के नैदानिक उपयोगिता पर प्रारंभिक रिपोर्ट के रूप में १९९९ के रूप में वापस दूर है, जब 2 स्वतंत्र अध्ययन की सूचना दी है कि कोई या एक ंयूनतम दैहिक hypermutation (SHM) लोड (विलक्षण CLL, U-CLL) के साथ रोगियों को ले जाने से एक बदतर रोग का निदान उच्चतर SHM बोझ (रूपांतरित CLL, एम-CLL)६,७. अधिक विशेष रूप से, U-CLL समूह के कुछ या कोई SHM और इसलिए निकटतम germline IGHV जीन (≥ ९८%), के लिए एक उच्च प्रतिशत की पहचान के साथ clonotypic IGHV जीन बंदरगाह मामलों के शामिल है, जबकि एम-CLL एक उच्च उत्परिवर्तन लोड (प्रतिशत पहचान के साथ मामलों के शामिल निकटतम germline IGHV जीन < 98%) । इन प्रारंभिक अध्ययनों के बाद से यह लगातार दिखा दिया गया है कि यू-CLL मामलों में कम समय के लिए पहली उपचार (TTFT) और समग्र अस्तित्व (ओएस) एम-CLL की तुलना में प्रदर्शित ।
मसा में, इन प्राथमिक अध्ययन बी सेल रिसेप्टर (BcR) CLL pathobiology में ़ की निर्णायक भूमिका पर प्रकाश डाला, इस प्रकार CLL में व्यापक अनुसंधान के लिए जिस तरह फ़र्श-microenvironmental बातचीत, बारी में, की एक और अधिक व्यापक सराहना करने के लिए नेतृत्व इस रोग की जैविक विविधता८,९. अधिक हाल के अध्ययनों से CLL में immunogenetic विश्लेषण के महत्व के लिए अतिरिक्त सहायता प्रदान की है खुलासा है कि व्यक्तिगत मामलों के उपक्रमों में साझा करने के कारण क्लस्टर मई (अर्ध) समान BcR ़ जीन जुगाड़, एक घटना BcR ़ stereotypy10 ,११,१२,१३. सबूत संचित धारणा है कि रोगियों को एक ही छवि सबसेट बंदरगाह समान clinicobiological गुण है कि स्पष्ट रूप से उंहें एक ही SHM श्रेणी के भीतर अंय CLL रोगियों से अलग है लेकिन अलग ़ जीन दृश्यों के साथ, को सौंपा का समर्थन करता है; यह वास्तव में बताया गया है कि BcR ़ stereotypy के आधार पर CLL रोगियों की वर्गीकरण आगे यू में CLL रोगियों के थोक अलगाव को परिष्कृत-CLL या एम CLL समूहों14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20।
एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य से, यह उल्लेखनीय है कि clonotypic IGHV जीन की SHM स्थिति chemoimmunotherapy के लिए एक विशिष्ट प्रतिक्रिया के साथ सहसंबंधी करने के लिए लगता है । विशेष रूप से, M-CLL रोगियों fludarabine/cyclophosphamide/rituximab (FCR) के संयोजन के साथ इलाज किया, चिकित्सकीय फिट CLL जीन दोषों की कमी रोगियों के लिए सोने के मानक उपचार, काफी लंबी प्रगति प्रदर्शित-मुक्त जीवन रक्षा (PFS) और ओएस की तुलना में U-CLL रोगियों को जो एक ही उपचार प्राप्त21,22,23. इसलिए, SHM स्थिति की पहचान विशेष रूप से CLL रोगियों अर्थात् के चिकित्सीय प्रबंधन में सहायता के लिए महत्वपूर्ण हो गया है, एक पूर्वानुमान मार्कर, बल्कि रोग के नैदानिक पाठ्यक्रम का आकलन करने के लिए के बजाय , एक शकुन मार्कर. वास्तव में, NCI के हाल ही के अद्यतन के अनुसार CLL पर अंतर्राष्ट्रीय कार्यशाला से दिशानिर्देश प्रायोजित, पुनर्व्यवस्थित IGHV जीन की SHM स्थिति सभी CLL मामलों में सामांय अभ्यास और नैदानिक दोनों में उपचार दीक्षा से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए परीक्षण24. इसके अलावा, उपंयास उपचार एजेंटों के हाल ही में अनुमोदन के कारण, और परीक्षणों में दवाओं की बढ़ती संख्या, ़ अणु के SHM स्थिति निकट भविष्य5में CLL के साथ रोगियों के चिकित्सीय प्रबंधन में एक भी बड़ी भूमिका निभा सकता है ।
इस रिपोर्ट का ब्यौरा आइजी जीन अनुक्रम विश्लेषण के सभी पहलुओं, उपयुक्त सामग्री को चुनने और अनुक्रमण परिणामों की नैदानिक व्याख्या के साथ समापन के साथ शुरुआत । इन चरणों के गहन मूल्यांकन में विश्वसनीय परिणाम के उत्पादन के लिए नैदानिक दिनचर्या में महत्वपूर्ण है और नैदानिक परीक्षणों के भीतर सटीक रोगी स्तरीकरण सुनिश्चित करने के लिए । प्रोटोकॉल के लिए आइजी जीन अनुक्रम विश्लेषण के अनुरूप में सहायता प्रदान की जाती हैं, इस प्रकार सुनिश्चित करना है कि परिणाम विभिंन प्रयोगशालाओं के बीच तुलना कर रहे हैं ।
CLL में ़ जीन का अध्ययन न केवल रोग pathobiology में एक बेहतर समझ प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी रोगी जोखिम स्तरीकरण में सुधार के लिए । यह इसलिए सर्वोपरि है कि बहु-चरण की प्रक्रिया ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण और क्रमिक आंकड़ों के बाद की व्याख्या एक मानकीकृत तरीके से किया जाता है । उपयुक्त और पर्याप्त रोगी सामग्री की उपलब्धता और नमूने के समय के बाद से परीक्षण पंजाब पर प्रदर्शन किया जा सकता है और एक उच्च CLL ट्यूमर सेल गिनती के साथ किसी भी नमूने पर ़ जीन उत्परिवर्तन विश्लेषण करने की क्षमता पर प्रभाव नहीं होना चाहिए । रक्त mononuclear कोशिकाओं के जुदाई ढाल जुदाई तरीकों का उपयोग नियमित रूप से नैदानिक प्रयोगशालाओं में किया जाता है, और हमेशा की तरह, देखभाल जब रक्त जोड़ने/RPMI ढाल युक्त ट्यूब के समाधान के लिए लिया जाना चाहिए; यह कार्य एक धीमी, कोमल तरीके से ढाल परेशान और कोशिकाओं की हानि को रोकने से बचने के लिए किया जाना चाहिए ।
कोशिका जुदाई के बाद, न्यूक्लिक एसिड निकाले जाते हैं । दोनों gDNA और सीडीएनए clonotypic ि्ग पुनर्व्यवस्था के SHM विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं, तथापि, वहां या तो सामग्री के उपयोग के लिए लाभ और नुकसान कर रहे हैं । प्रयोगशाला कार्यप्रवाह जल्दी जब gDNA का उपयोग कर के बाद से कोई रिवर्स प्रतिलेखन के लिए पीसीआर प्रवर्धन से पहले प्रदर्शन किया जाना है आय । उस ने कहा, पीसीआर के लिए सब्सट्रेट के रूप में gDNA का उपयोग दोनों उत्पादक और अनुत्पादक पुनर्व्यवस्थाओं के प्रवर्धन में परिणाम हो सकता है, जो बारी में, अतिरिक्त हाथ प्रयोगशाला काम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यानी, कई पीसीआर उत्पादों की शुद्धि या जेल उत्पाद शुल्क और सभी पुनर्व्यवस्थाओं के व्यक्तिगत अनुक्रमण । जब gDNA और सीडीएनए दृष्टिकोण की तुलना, बाद के लिए एक रिवर्स प्रतिलेखन कदम पीसीआर प्रवर्धन के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रदर्शन किया जाना चाहिए । हालांकि, इस उदाहरण में, अधिकांश मामलों के लिए, केवल उत्पादक ़ पुनर्व्यवस्थाओं को परिलक्षित और बाद में अनुक्रम किया जाएगा । इस प्रकार, केवल एक ही पीसीआर उत्पाद शुद्ध और अनुक्रम होगा, जबकि परिणाम व्याख्या और अधिक सरल है ।
प्रवर्धन की दक्षता काफी हद तक gDNA/सीडीएनए, जो एक संवेदनशील ठहराव विधि का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, और प्राइमरों का उपयोग । प्राइमरों का इस्तेमाल संपूर्ण विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि SHM स्तर का सही निर्धारण केवल पुनर्व्यवस्थित IGHV जीन के पूरे अनुक्रम को बढ़ाना द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । एक पूर्ण लंबाई की व्यवस्था ही अगर 5 ‘ IGHV नेता प्राइमरों का इस्तेमाल कर रहे है मूल्यांकन किया जा सकता है, जिससे एरिक ने नेता प्राइमरों के प्रयोग के लिए हाल ही में सिफारिशों को सही ठहराते27। वैकल्पिक प्राइमरों का उपयोग, अपूर्ण IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था के प्रवर्धन के लिए अग्रणी, IGHV जीन उत्परिवर्तन विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है, और इसलिए दृढ़ता के खिलाफ की सलाह दी । एकमात्र अपवाद मामलों से संबंधित है जो बार नकारात्मक परिणाम जब IGHV नेता प्राइमरों का इस्तेमाल किया और नए रोगी सामग्री का विश्लेषण कर रहे है या तो संभव नहीं है या भी परिणाम उपज नहीं है । यदि एक अलग रोगी नमूना और/या सामग्री (gDNA/सीडीएनए) और विभिंन प्राइमरों का उपयोग अभी भी एक पीसीआर उत्पाद का उत्पादन करने में विफल सेट, संभावित कारणों से हो सकता है कि ट्यूमर कोशिका बोझ बहुत कम है या कि lymphocytosis एक CLL क्लोन के कारण नहीं है (जो मामले में immunophenotype का पुनः मूल्यांकन किया जाना चाहिए). विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों हमेशा नैदानिक रिपोर्ट में कहा जाना चाहिए ।
मोनोक्लोनल बी कोशिकाओं के संचय से CLL परिणाम के रूप में एक ही IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था असर, मामलों के विशाल बहुमत के लिए clonality आकलन एक अनूठा मोनोक्लोनल शिखर, यानी, एक क्लोन प्रकट होगा । दुर्लभ अवसरों पर, डबल rearrangement या भी oligoclonal पैटर्न३५मनाया जा सकता है । ऐसे मामलों में, जेल ट्रो clonality आकलन और टुकड़ा विश्लेषण जैसे अधिक संवेदनशील तरीकों के लिए पसंदीदा तकनीक नहीं है लागू किया जाना चाहिए । एक बार clonality की पुष्टि की गई है, अनुक्रमण करने से पहले अंतिम कदम पीसीआर उत्पाद की शुद्धि से संबंधित है सुनिश्चित करने के लिए कि उच्च गुणवत्ता के अनुक्रम प्राप्त कर रहे हैं । अंत में, IMGT/वी-क्वेस्ट उपकरण संसाधन एरिक द्वारा आइजी अनुक्रम विश्लेषण के लिए सिफारिश की है । के रूप में IMGT डेटाबेस लगातार अद्यतन कर रहे है और एक साथ मिलकर और अच्छी तरह से व्याख्या तरीके में परिणाम रिपोर्ट, इस उपकरण मानकीकृत विश्लेषण सुनिश्चित करता है और विभिंन नैदानिक या शैक्षणिक सुविधाओं के बीच तुलनात्मक विश्लेषण की सुविधा ।
CLL में immunogenetic विश्लेषण के रूप में शकुन है और, विशेष रूप से, पूर्वानुमान निहितार्थ, IGHV के मजबूत विश्लेषण-IGHD-IGHJ प्रमुख CLL के लिए असाइनमेंट सहित जीन पुनर्व्यवस्था, अब केवल वांछनीय है, लेकिन महत्वपूर्ण महत्व की । यह उपंयास चिकित्सीय और क्षमता के इस युग में विशेष रूप से स्पष्ट है कि ़ जीन विश्लेषण के लिए उपचार के निर्णय गाइड है5,21,22,23,३६,३७ ,३८, के रूप में आधिकारिक तौर पर NCI के हाल ही में अद्यतन द्वारा संकेत-24CLL पर अंतरराष्ट्रीय कार्यशाला से दिशानिर्देश प्रायोजित । उस ने कहा, कठोर मानकों का वारंट, विशेष रूप से clonotypic के SHM स्थिति के निर्धारण के रूप में IGHV CLL रोगियों में जीन पुनर्व्यवस्थित कर रहे है एक तुच्छ बात नहीं है और एक बहु कदम प्रक्रिया शामिल है । महत्वपूर्ण बात, कुछ प्रायोगिक कदम, सबसे विशेष रूप से प्राइमरों के विकल्प, जब विशिष्ट विकल्प और/या दृष्टिकोण का पालन कर रहे है बेहतर परिणाम उपज, अंय तकनीकी पहलुओं के लचीलेपन के कुछ अंश के लिए उत्तरदाई हैं, जैसे सामग्री चयन या clonality का आकलन करने के लिए विधि, तथ्य यह है कि वे सूक्ष्म मतभेद के लिए नेतृत्व के कारण, यदि कोई हो, अंतिम परिणाम के संबंध में.
पिछले दशक से अधिक, एरिक मानकीकरण और विभिंन CLL निदान और शकुन के लिए उचित तरीकों के अनुरूपता को बढ़ावा देने के लिए प्रयासरत है । यह प्रकाशित सिफारिशों और immunogenetic विश्लेषण के लिए दिशानिर्देश27,३४, कई संगठित शैक्षिक कार्यशालाओं और घटनाओं, एक आइजी नेटवर्क की स्थापना, साथ ही साथ एक विशेषज्ञ ऑनलाइन मंच में परिलक्षित होता है चर्चा और CLL में ़ जीन अनुक्रम व्याख्या पर मार्गदर्शन प्रदान करते हैं । इन कार्यों के माध्यम से एरिक के समग्र लक्ष्य इष्टतम नैदानिक प्रबंधन और रोगी की देखभाल को बढ़ावा देने के लिए है । तीव्र प्रयासों के बावजूद, इस कार्य को पूरा से दूर है, और वास्तव में उपंयास उच्च प्रवाह प्रतिरक्षा रूपरेखा के उद्देश्य से अनुक्रमण के विकास के कारण और अधिक जटिल हो गया है । फिर भी, हालांकि चुनौतियां बनी रहती है, CLL में आइजी जीन विश्लेषण के मजबूत मानकीकरण के लिए गहन प्रयास जारी है और वर्तमान में एरिक के भीतर चल रही गतिविधियों का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं ।
The authors have nothing to disclose.
हम अपने अनुसंधान समूहों के वर्तमान और पिछले सदस्यों, IgCLL समूह और एरिक, उनकी प्रतिबद्धता और CLL में immunogenetics अध्ययन में उत्साह के लिए धंयवाद । हम यह भी IMGT/CLL-DB पहल के सभी सदस्यों के भरोसेमंद सहयोग को स्वीकार करना चाहूंगा और, विशेष रूप से, प्रोफेसर मैरी-पॉल Lefranc और डॉ Veronique Giudicelli, Laboratoire d’Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite मोंटेपेल्लियर द्वितीय, मोंटेपेल्लियर, फ्रांस, और IMGT, अंतरराष्ट्रीय ImMunoGeneTics सूचना प्रणाली, उनके भारी समर्थन के लिए और ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण के साथ मदद करते हैं । यह काम TRANSCAN-१७९ उपंयास JTC २०१६ से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया; Associazione Italiana प्रति ला Ricerca सुल कांसरो AIRC (जांचकर्ता अनुदान #20246 और विशेष कार्यक्रम आणविक नैदानिक ऑन्कोलॉजी-5 प्रति मिलिंग #9965), मिलानो, इटली; ईटली di Rilevante Interesse Nazionale (पृण) #2015ZMRFEA, MIUR, रोम, इटली; स्वीडिश कैंसर सोसायटी, स्वीडिश अनुसंधान परिषद, Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन, कारोलिंस्का Institutet, उपसाला विश्वविद्यालय, उपसाला विश्वविद्यालय अस्पताल और शेर के कैंसर रिसर्च फाउंडेशन, उपसाला; ओडीसियस कार्यक्रम, अनुसंधान और तकनीकी क्षेत्र पर सामरिक विकास के लिए “कार्रवाई” के तहत कार्यान्वित, संचालन कार्यक्रम “प्रतिस्पर्धात्मकता, उद्यमिता और नवाचार” द्वारा वित्त पोषित “(NSRF 2014-2020) और ग्रीस द्वारा वित्त पोषण और सह यूरोपीय संघ (यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि) ।
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube – Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
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