Tranches de cerveau-hypophyse saines pour les études électrophysiologiques des cellules hypophysaires chez les poissons téléostéens

Résumé

L’article décrit un protocole optimisé pour faire des tranches de tissus de cerveau-hypophysaire viables, en utilisant le médaka poissons téléostéens (Oryzias latipes), suivie par des enregistrements électrophysiologiques des cellules hypophysaires en utilisant la technique de patch clamp avec le configuration de patch perforé.

Résumé

Des études électrophysiologiques des cellules hypophysaires ont été menées dans nombreuses espèces de vertébrés, mais très peu chez les poissons téléostéens. Parmi ceux-ci, la nette majorité ont été réalisée sur des cellules primaires dissociées. Pour améliorer notre compréhension des cellules hypophysaires chez les téléostéens comment se comporter dans un milieu biologiquement plus adéquat, ce protocole montre comment préparer des tranches de cerveau-hypophysaire viables utilisant le médaka de petits poissons d’eau douce (Oryzias latipes). Faire des tranches de cerveau-hypophysaire, pH et l’osmolarité de toutes les solutions ont été ajustées aux valeurs contenues dans les fluides corporels de poissons d’eau douce vivant à 25 à 28 ° C. Après préparation de tranches, le protocole montre comment effectuer les enregistrements électrophysiologiques en utilisant la technique de patch-clamp de la cellule entière perforé. La technique du patch-clamp est un outil puissant avec résolution temporelle sans précédent et sensibilité, permettant l’étude des propriétés électriques des cellules entières intacts jusqu'à des canaux ioniques isolés. Patch perforé est unique en ce qu’il garde l’environnement intracellulaire intact empêchant des éléments de régulation dans le cytosol de dilution de la solution d’électrodes patch pipette. En revanche, lorsque vous effectuez des enregistrements de cellules entières traditionnelles, on a observé que les cellules hypophysaires médaka perdent rapidement leur capacité à tirer des potentiels d’action. Parmi les diverses techniques de perforation disponibles, ce protocole montre comment atteindre la perforation de la membrane raccordée à l’aide du fongicide amphotéricine b.

Introduction

L’hypophyse est un organe clef endocrine chez les vertébrés situés au-dessous de l’hypothalamus et derrière le chiasma optique. Il produit et sécrète des hormones de six à huit des types spécifiques de cellules. Hormones hypophysaires constituent un intermédiaire entre le cerveau et les organes périphériques et conduire un large éventail de processus physiologiques essentiels dont la croissance, la reproduction et la régulation de l’homéostasie. Similaire aux neurones, les cellules endocrines de l’hypophyse sont électriquement excitables avec la possibilité de tirer des potentiels d’action spontanément ¹. Le rôle de ces potentiels d’action est ....

Protocole

Tous les animaux de manutention a été réalisée conformément aux recommandations pour les soins et le bien-être des animaux de recherche à l’Université norvégienne des Sciences de la vie et sous la supervision des enquêteurs agréés.

1. préparation des Instruments et Solutions

Remarque : Toutes les solutions doivent être stériles. Il faudrait une attention particulière pour le pH et l’osmolarité (osmol/kg d’eau) de toutes les solutions, qui doit être soigneusement adaptée à l’environnement extracellulaire des espèces étudiées. pH et l’osmolalité doivent être ajustées avec un appareil électronique précis tels que le p....

Résultats

Ce protocole montre un protocole étape par étape comment réaliser des enregistrements électrophysiologiques fiables des cellules de l’hypophyse (gonadotrope), en utilisant une ligne de médakas transgéniques [Tg (lhb- hrGfpII)] où la cible des cellules (gonadotropes Lh-production) sont étiquetés avec la protéine fluorescente verte (GFP).

Au départ, les études électrophysiologiques ont été effectuées à l’aide de la config.......

Discussion

Des enregistrements électrophysiologiques utilisant la technique du patch-clamp sur des tranches de cerveau-hypophysaire nécessitent optimisation minutieuse. Des protocoles bien optimisés pour mener des enquêtes de cellules vivantes spécifiquement chez les téléostéens sont limitées, la majorité des publications à l’aide de protocoles basés sur les systèmes mammaliens. À cet égard, il est important d’être conscient du fait que plusieurs paramètres physiologiques tels que pH et l’osmolalité sont non seulement les espèces d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vibratome	Leica	VT1000 S
Colle chirurgicale	WPI	VETBOND	3M Vetbond Adhésif pour tissus
Lames en acier inoxydable	Campden Instruments	752-1-SS
moules métalliques	SAKURA	4122
harpe en acier	Warner instruments	64-1417
PBS	SIGMA	D8537
Pipettes patch ultra-pures LMP agarose	invitrogen	166520-100
	Sutter Instrument	BF150-110-10HP	Borosilicate avec filament D.E. :1,5 mm, D.I. :10 mm
Microscope Slicescope	Scientifica	pro6000
P-Clamp10	Molecular Devices	#1-2500-0180	sofware
Numériseur Digidata 1550A1	Molecular Devices	DD1550
Amplificateur Multiclap 700B Headstage CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B
GnRH	Bachem	4108604	H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH sel de trifluoroacétate  ;
extracteur de pipette	Sutter Instrument	P-1000
amphotéricine B	SIGMA	A9528	antibiotique poreux
polyéthylénamine  ;	SIGMA	P3143	50 % PEI solution
microfiler	seringue WPI	MF28/g67-5
verre pour le pont en gélose	Sutter Instrument	BF200-116-15	Borosilicate avec filament D.E. :2.0 mm, I.D. :1.16 mm Logiciel
Micro-Manager poli au feu Logiciel			microscopie Open Source Logiciel de microscopie
optiMOS sCMOS caméra	Qimaging	; 01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicateur	Elma	D-7700 singen
NaCl	SiGMA	S3014
KCl	SiGMA	P9541
MgCl2	SiGMA	M8266
D-Glucose	SiGMA	G5400
Hepes	SiGMA	H4034
CaCl< sub>2	SiGMA	C8106
Saccharose	SiGMA	84097
D-mannitol	SiGMA	63565
MES-acid	SIGMA	M0895
BSA	SIGMA	A2153

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