卵巢组织培养对小鼠卵巢现象的可视化
Summary
卵巢组织培养可作为卵泡发育、排卵和卵泡闭锁的模型, 并表明动态卵巢过程的调控机制。
Abstract
哺乳类雌性在每一个发情周期中周期性地排卵卵母细胞的数量。为了维持这种规律性和周期性, 调节发生在下丘脑-垂体-性腺轴水平和发展卵泡在卵巢。尽管有积极的研究, 卵泡发育机制还不清楚, 因为从休眠的原始卵泡活化到排卵的几个步骤, 以及在每个卵泡阶段不同的调节复杂性。为了研究卵泡发育的机制, 以及整个发情周期中卵泡的动态, 我们开发了一种小鼠卵巢组织培养模型, 可以用显微镜观察卵泡发育。系统卵泡发育、周期性排卵和卵泡闭锁均可在培养的卵巢模型中重现, 培养条件可以进行实验性调节。在这里, 我们展示了这种方法在研究卵泡发育和其他卵巢现象的调控机制方面的用处。
Introduction
雌性小鼠卵巢含有数千卵泡1, 周期性排卵在每个发情周期内成熟约十只卵母细胞。卵泡分为几个发育阶段: 原始的, 初级的, 次级的, 胃窦, 和德赫拉夫卵泡, 取决于每个卵母细胞周围的颗粒细胞层的形式。大多数原始卵泡处于休眠状态, 其中一些在2的发情周期中被激活并生长为初级卵泡。继发卵泡期后, 卵泡发育主要由促性腺激素、卵泡刺激激素 (FSH) 和促黄体素 (LH) 调节。然而, 原始和初级卵泡发育独立于促性腺激素, 控制这些阶段的调控机制仍然很差, inderstood3,4,5。除了生长因子和激素, 原始和主要卵泡由卵泡6,7之间的相互作用调节。因此, 我们对小鼠卵巢组织中卵泡动力学进行了分析, 并研究了卵巢组织培养8、9、10相关的调控机制。
本文介绍了两种卵巢组织培养模型的方法。第一种是通过对卵泡区的测量来分析卵泡发育, 第二种是利用转基因小鼠对早期卵泡发育过程中的调控机制进行研究。对于卵泡发育分析, 我们主要使用4周大的雌性小鼠的卵巢, 因为它们允许容易的卵泡可视化。为诱导周期性排卵和体外卵泡发育模型, 我们在组织培养条件下, 复制 LH、观察排卵、卵泡闭锁和雌二醇分泌。对卵巢上皮细胞进行了图像采集, 并通过对卵泡区变化的追踪分析, 对卵泡发育过程进行了研究。然而, 在明亮的田间显微分析中, 原始和早期卵泡的区别还不清楚。因此, 我们开发了一种检测小卵泡的方法, 并用Oogenesin1 (Oog1) pro3对卵巢组织中的原始、初级和次生卵泡进行鉴别。9和R26-H2B-mCherry转基因小鼠卵巢在0天和4以后出生11。Oog1的表达在卵母细胞进入减数分裂后可以检测到, 随着卵泡发育逐渐增加, 允许观察从原始卵泡到原发毛囊的过渡过程, 使用卵巢组织的时间推移图像11 ,12。虽然形态学方法已经被用来研究激活休眠的原始卵泡13,14,15,16, 卵巢生理卵泡发育的因素是难以观察, 各种因素的影响依然 uncharacterized。目前的文化方法是为了解决这一缺乏实时分析的目标因素。
在本研究中, 我们用时间推移成像方法追踪卵泡发育, 并以卵泡发育过程为特征。我们的新方法为研究卵巢的生理提供了一个空前的工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本研究中, 我们开发了两种新的方法来研究卵泡发育的小鼠卵巢。第一种方法涉及卵巢切片成年小鼠组织的培养, 其次是卵泡发育的分析, 第二种是在促性腺激素独立阶段, 利用时间推移成像对早期卵泡发育进行可视化。在此之前, 我们用目前的卵巢组织培养方法来评估白血病抑制因子和孕酮对卵泡发育的影响8,9, 并表明其影响不同的浓度和卵泡阶段。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Naojiro 南 (京都大学) 博士提供Oog1pro3.9小鼠。这项研究得到了 jsp (KAKENHI # JP15H06275) 和日东基金会的支持。
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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