Æggestokkene væv kultur at visualisere fænomener i mus æggestok
Summary
Æggestokkene vævskulturer kan bruges som modeller for follikel udvikling, ægløsning og follikel atresi og angive reguleringsmekanismer af dynamiske æggestokkene processer.
Abstract
Pattedyr hunner ægløsning regelmæssigt en næsten konstant antal oocyter under hver estrus cyklus. For at opretholde sådan regelmæssighed og hyppighed, opstår forordning på hypothalamus-hypofyse-gonadale akse og på udvikling af follikler i æggestokkene. Trods aktive undersøgelser er follikel udvikling mekanismer ikke klare på grund af de flere trin involveret fra hvilende primordiale follikel aktivering til ægløsning, og forordningens kompleksitet, der er forskellig på hver follikulære fase. For at undersøge mekanismerne af follikel udvikling og dynamikken i follikler i hele estrus cyklus, udviklede vi en mus æggestokkene vævskultur model, der kan bruges til at observere follikel udvikling ved hjælp af et mikroskop. Systematisk follikel udvikling, periodiske ægløsning og follikel atresi kan alle gengives i modellen kulturperler æggestokken, og dyrkningsbetingelserne kan moduleres eksperimentelt. Her, påvise vi nytten af denne metode i studiet af de reguleringsmekanismer follikel udvikling og andre æggestokkene fænomener.
Introduction
Kvindelige mus æggestokke indeholder flere tusinde follikler1, og periodiske ægløsning modnes cirka ti oocyter på hver estrus cyklus. Follikler er inddelt i flere udviklingsstadier: primordial, primær, sekundær, antral, og Graafsk follikler, afhængig af, hvilken granulosa cellulære lag omkring hvert oocyt. De fleste primordiale follikler er i dvale, og nogle af dem er aktiveret og vokse ind i primære follikler på hver estrus cyklus2. Efter den sekundære follikulære fase, er follikel udvikling hovedsagelig reguleret af gonadotropiner, follikulært stimulerende hormon (FSH) og luteiniserende hormon (LH). Dog primordial og primære follikel udvikling er uafhængig af gonadotropin, og de regulerende mekanismer, der styrer disse stadier forbliver dårligt inderstood3,4,5. Ud over vækst faktorer og hormoner, er ur og primære hårsækken reguleret af interaktionerne mellem follikler6,7. Derfor, vi udførte analyser af follikel dynamics i mus æggestokkene væv, og undersøgt de tilknyttede reguleringsmekanismer ved hjælp af æggestokkene vævskulturer8,9,10.
Heri, introducere vi to æggestokke vævskultur model metoder. Først bruges til at analysere follikel udvikling af måling af follikulært områder, og andet bruges til at studere den regulerende mekanisme i den tidlige follikel udvikling fra ur til sekundære follikel fase med Transgene mus. For follikel udvikling analyse brugte vi hovedsageligt æggestokkene af 4 – uger gamle hunmus fordi de giver mulighed for nem visualisering af follikler. For at fremkalde periodiske ægløsning og model i vivo follikel udvikling, gengivet vi LH surge og observerede ægløsning, follikel atresi og sekretion af estradiol vævskultur betingelser. Billeder af kulturperler æggestokkene blev erobret, og udviklingsprocesser follikel blev analyseret af sporing af ændringer i området follikulært. Men i lysfelt mikroskopi analyser, sondringen mellem primordial og tidlige primære follikler var uklart. Dermed, vi udviklet en metode til at opdage små follikler, og skelne mellem primordial, primære, og sekundære follikel i kulturperler æggestokkene væv ved hjælp af Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 og R26-H2B-mCherry Transgene mus æggestokkene på dage 0 og 4 efter fødslen11. Oog1 udtryk kan spores i oocyter efter ibrugtagning meiose, og øges gradvist med follikel udvikling, giver mulighed for observation af overgangen fra primordial til primære follikler ved hjælp af time-lapse billeder af kulturperler æggestokkene væv11 ,12. Selvom morfologiske metoder har været brugt til at studere faktorer, der aktiverer hvilende primordiale follikler13,14,15,16, er fysiologiske follikel udvikling i æggestokkene vanskeligt at observere, og virkningerne af forskellige faktorer forblive uncharacterized. De nuværende kultur metoder var designet til at løse denne mangel i realtid analyser af target faktorer.
I den foreliggende undersøgelse, vi sporede follikulære udvikling ved hjælp af en time-lapse billedmetoden og karakteriseret processen med udvikling af hårsækken. Vores nye metoder giver en hidtil uset værktøj for at undersøge fysiologi af æggestokkene.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse udviklede vi to nye metoder til at studere follikel udvikling i mus æggestokke. Den første metode indebærer kultur af skiveskåret æggestokkene voksne mus væv efterfulgt af analyser af follikel udvikling, og for det andet indebærer anvendelse af time-lapse imaging for at visualisere tidlige follikel udvikling stadiet gonadotropin-uafhængig. Tidligere vi anvendte den nuværende æggestokken vævskultur metode til at vurdere effekten af leukæmi hæmmende faktor og progesteron på follikel udvi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) for at give Oog1pro3.9 mus. Denne forskning blev støttet af JSP’ER (KAKENHI # JP15H06275) og Nitto Foundation.
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
