Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse
Summary
Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.
Abstract
As fêmeas de mamíferos ovulam periodicamente um número quase constante de oócitos durante cada ciclo de cio. Para sustentar tal regularidade e periodicidade, regulamento ocorre no nível do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal e no desenvolvimento de folículos nos ovários. Apesar dos estudos ativos, mecanismos de desenvolvimento do folículo não são claros, devido as diversas etapas envolvidas desde a ativação do folículo primordial dormente a ovulação e devido a complexidade de regulamento que difere em cada fase folicular. Para investigar os mecanismos do desenvolvimento folicular e a dinâmica dos folículos durante todo o ciclo do estro, desenvolvemos um modelo de cultura de tecido ovariano de mouse que pode ser usado para observar o desenvolvimento folicular usando um microscópio. Desenvolvimento sistemático folicular, ovulação periódica e atresia do folículo podem ser reproduzidos no modelo do culto do ovário, e as condições de cultura podem ser moduladas experimentalmente. Aqui, vamos demonstrar a utilidade desse método no estudo dos mecanismos de regulação do desenvolvimento folicular e outros fenômenos no ovário.
Introduction
Ovários de rato fêmea contenham vários milhares de folículos1e ovulação periódica amadurece aproximadamente dez ovócitos em cada ciclo de cio. Os folículos são classificados em vários estádios de desenvolvimento: primordial, primária, secundária, antral e folículos de Graaf, dependendo da forma da camada granulosa celular ao redor de cada oócito. A maioria dos folículos primordiais são dormentes, e alguns deles são ativados e crescem em folículos primários em cada ciclo de cio2. Após a fase folicular secundária, desenvolvimento folicular é principalmente regulado por gonadotrofinas, foliculares estimulante hormônio (FSH) e hormônio luteinizante (LH). No entanto, desenvolvimento do folículo primário e primordial é independente de gonadotrofinas, e os mecanismos de regulação que regem esses estágios permanecem mal inderstood3,4,5. Além de hormônios e fatores de crescimento, o folículo primário e primordial é regulado pelas interações entre folículos6,7. Portanto, realizamos análises de dinâmica de folículo nos tecidos do ovário de rato e investigou os mecanismos de regulação associados usando culturas de tecido ovariano8,9,10.
Neste documento, apresentamos dois métodos de modelo de cultura de tecido ovariano. O primeiro é usado para analisar o desenvolvimento do folículo por medição de superfícies foliculares, e a segunda é usada para estudar o mecanismo regulatório durante o início do desenvolvimento folicular de primordial para a fase de folículo secundário com ratos transgénicos. Para análise do desenvolvimento do folículo, utilizado principalmente ovários de camundongos fêmeas 4 semana de idade porque permitem fácil visualização dos folículos. Para induzir a ovulação periódica e o desenvolvimento de modelos em vivo do folículo, nós reproduzido o aumento de LH e ovulação observada, atresia do folículo e secreção de estradiol em condições de cultura de tecidos. Imagens dos ovários cultivadas foram capturadas, e os processos de desenvolvimento do folículo foram analisados por mudanças de rastreamento na área folicular. No entanto, nas análises de microscopia de campo claro, a distinção entre folículos primários primordiais e no início era clara. Assim, desenvolvemos um método para detectar pequenos folículos e distinguir entre o primordial, primário, e culta de folículo secundário em tecidos ovarianos usando Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 e ovários de camundongos transgênicos R26-H2B-mCherry nos dias 0 e 4 após nascimento11. Oog1 expressão é detectável em oócitos após a entrada em meiose e aumenta gradualmente com o desenvolvimento do folículo, permitindo a observação da transição do primordial de folículos primários usando imagens de lapso de tempo do tecido do ovário culta11 ,12. Embora métodos morfológicos foram usados para estudar os fatores que ativam dormente folículos primordiais13,14,15,16, desenvolvimento do folículo fisiológicas nos ovários é difícil de observar, e os efeitos dos vários fatores permanecem descaracterizados. Os métodos de cultura presente foram projetados para resolver esta escassez nas análises em tempo real dos fatores de alvo.
No presente estudo, nós controladas desenvolvimento folicular usando um método de imagem de lapso de tempo e caracteriza-se o processo de desenvolvimento do folículo. Nossos novos métodos para oferecer uma ferramenta sem precedentes para investigar a fisiologia dos ovários.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, desenvolvemos dois novos métodos para o estudo do desenvolvimento folicular em ovários de rato. O primeiro método envolve a cultura de tecidos de ratos adultos ovário fatiado seguido por análises do desenvolvimento folicular, e o segundo envolve o uso de time-lapse de imagem para visualizar o início do desenvolvimento folicular durante a fase independente de gonadotrofinas. Anteriormente, usamos o presente método de cultura de tecido do ovário para avaliar o efeito de fator inibitório de leucemia e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) para fornecer os ratos Oog1pro3.9 . Esta pesquisa foi apoiada pelos JSPS (KAKENHI # JP15H06275) e a Fundação Nitto.
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
