Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop
Summary
Substrate mit Steifheit im Bereich Kilopascal sind nützlich, um die Reaktion der Zellen auf physiologisch relevanten Mikroumgebung Steifigkeit zu studieren. Verwenden nur ein Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop, kann des Elastizitätsmoduls weichen Silikon-Gel mit einer Einbuchtung mit einer geeigneten Kugel bestimmt werden.
Abstract
Weiche Gewebe im menschlichen Körper haben in der Regel Steifigkeit im Bereich Kilopascal (kPa). Entsprechend, Silikon und Hydrogel flexible Substrate nachweislich nützliche Substrate für die Kultivierung von Zellen in einem physischen Mikroumgebung, die teilweise in Vivo Bedingungen imitiert werden. Hier präsentieren wir Ihnen ein einfaches Protokoll für die Charakterisierung der Youngs Moduli isotrope lineare elastische Substrate, die in der Regel verwendet für Mechanobiology Studien. Das Protokoll besteht aus Vorbereitung eine weiche Silikon-Substrat auf einer Petrischale oder steif Silikon, Beschichtung der Oberfläche des Substrates Silikon mit fluoreszierenden Perlen, mit Hilfe einer Millimeter-Skala-Kugel an die Oberseite (durch die Schwerkraft), imaging die fluoreszierenden Einrücken Perlen auf der eingerückten Silikon-Oberfläche mit dem Fluoreszenzmikroskop, und analysieren die resultierenden Bilder zur Berechnung des Elastizitätsmoduls des Substrats Silikon. Kopplung der Substrat-Oberfläche mit einem Moduli extrazelluläre Matrix Protein (neben der fluoreszierenden Perlen) ermöglicht das Silikon Substrat leicht für Zelle Beschichtung und anschließendem Studium mit Traktion Kraft-Mikroskopie Experimente verwendet werden. Der Einsatz von steifen Silikon, anstelle einer Petrischale als Basis aus weichem Silikon, ermöglicht die Verwendung von Mechanobiology Studien mit externen Strecke. Ein besonderen Vorteil dieses Protokolls ist, dass ein Fluoreszenzmikroskop Weitfeld, die allgemein verfügbar in vielen Labors ist für dieses Verfahren erforderlichen Geräte. Wir zeigen dieses Protokolls durch die Messung des Elastizitätsmoduls von weichem Silikon Substraten von verschiedenen elastischen Moduli.
Introduction
Zellen in den weichen Geweben befinden sich in einem Mikro-Umgebung deren Steifigkeit in Kilopascal Palette1, im Gegensatz zu Gewebekultur Gerichte ist deren Steifigkeit mehrere Größenordnungen höher ist. Frühe Experimente mit Zellen auf extrazelluläre Matrix Protein-beschichtete weichen Untergründen zeigte, dass die Steifigkeit des Substrats beeinflusst, wie Zellen bewegen sowie halten uns an die extrazelluläre Matrix unter2,3. In der Tat beeinflusst die Substrat-Steifigkeit grundlegend die Zelle Funktion4 in gewissem Sinne ähnlich durchdringend biochemische Signale. Polyacrylamid-Gele (beschichtet mit extrazellulärer matrixproteine) sind (Wasser durchdringt) Hydrogele, die ausgiebig genutzt wurden als Kultursubstrate Zelle für Mechanobiology5Studien. Polydimethylsiloxan (PDMS), das am häufigsten verwendete Silikon (Polysiloxan), hat als eine steife Silikon mit Megapascal-Palette Steifigkeit für Mikron-Skala Fertigung6verbreitet. Seit kurzem weichem Silikon, die Substrate mit Steifheit im Bereich mehr physiologisch relevanten Kilopascal als Zelle Kultursubstrate für Mechanobiology Studien7,8angestellt gewesen sein.
Verschiedene Methoden wurden verwendet, um die Steifigkeit der flexible Substrate, einschließlich Rasterkraftmikroskopie, makroskopische Deformation des ganzen Proben auf Dehnung, Rheologie und Einzug mit Kugeln und sphärisch gekippt Microindentors9 Messen . Während jede Technik ihre vor- und Nachteile hat, ist Einzug mit einer Kugel eine besonders einfache, aber ziemlich genaue Methode, die lediglich den Zugang zu einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop. Einzug mit einer metallischen Kugel wurde verwendet, um die Steifigkeit der Hydrogele in früheren Arbeiten3,9,10messen. Frühwerk, das die Wichtigkeit des Substrats Steifigkeit zu Zelle Bewegung gezeigt verwendet diese Methode, um festzustellen, Hydrogel Substrat Steifigkeit3. Vor kurzem hat konfokalen Mikroskopie auch für ein elegantes Charakterisierung10verwendet.
Hier präsentieren wir eine Schritt für Schritt-Protokoll für die Zubereitung von einem weichen Silikon-Substrat, Kupplung fluoreszierende Perlen (und eine extrazelluläre Matrix Proteine wie Kollagen ich) nur auf der Oberseite imaging eine Einrücken Sphäre und der oberen Oberfläche mit phase und Fluoreszenz imaging, beziehungsweise, und schließlich analysiert die Bilder zur Berechnung des Elastizitätsmoduls des Substrats Silikon. Das weiche Silikon-Substrat vorbereitet auf diese Weise kann problemlos für Traktion Kraft-Mikroskopie Experimente verwendet werden. Der Einsatz von steifen Silikon (anstelle einer Petrischale) als Basis für das weiche Silikon ermöglicht auch Mechanobiology Studien mit einem externen Strecke. Gerechtfertigt, sind praktische Erwägungen notwendig zur Vermeidung von möglichen Komplikationen auch angegeben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während die Kugel Einzug Methode einfach zu implementieren ist, Aufmerksamkeit auf die Wahl der Eindringkörper und die Dicke der Probe weichem Silikon zu entrichten. Die Gleichung zur Berechnung des Elastizitätsmoduls gilt unter einer Reihe von Bedingungen11und diese sind in der Regel erfüllt, wenn die Dicke der Probe Silikon > 10 % des Radius Eindringkörper ist und < ~ 13 x der Eindringkörper Radius. Wir fanden, dass Silikon Dicke von 5-10 x der Eindringkörper Radius eine gute Wahl, wobei …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Margaret Gardel für großzügig erlaubt die Verwendung von dem Rheometer. Wir erkennen an Unterstützung von den NIH (1R15GM116082), die diese Arbeit ermöglichte.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
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