広視野蛍光顕微鏡を用いたメカノバイオロジー研究の柔らかいシリコーン基板の剛性測定
Summary
Kilopascal 範囲内の剛性を有する基板は、生理学的に関連するマイクロ環境剛性に対する細胞の反応の研究に有用。ちょうど広視野の蛍光顕微鏡を用いた、柔らかいシリコーンのゲルのヤングは適切な球でインデントを使用して決定します。
Abstract
人体の軟部組織は通常 kilopascal (kPa) 範囲で剛性をあります。したがって、生体内での条件を部分的に模倣物理的な微小環境で細胞を培養用便利な基板にシリコーン ・ ハイドロゲルのフレキシブル基板を証明されています。ここでは、通常メカノバイオロジー研究用等方線形弾性基板のヤング係数を特徴付けるための単純なプロトコルを提案する.シャーレや硬いシリコンの柔らかいシリコーン基板を準備、蛍光ビーズを用いたシリコン基板の上面をコーティング、蛍光イメージング (重力) による上面をインデントするミリメートル単位球を用いたプロトコルの構成します。インデントされたシリコンの表面に蛍光顕微鏡を用いたシリコン基板のヤング率を計算する結果の画像解析にビーズ。(蛍光ビーズ) に加えて係数細胞外マトリックス蛋白質と基板の上面を結合セルめっきと牽引力顕微鏡実験を使用してその後の研究に使用する容易にシリコン基板をことができます。硬いシリコン、シャーレの代わりに柔らかいシリコーンのベースとして使用する外部ストレッチを含むメカノバイオロジー研究の使用。 にします。このプロトコルの特定の利点は、この手順で必要な主要機器である一般に利用できる多くのラボでは、広視野蛍光顕微鏡です。異なる弾性率の柔らかいシリコーン基板のヤング率を測定することによってこのプロトコルを示す.
Introduction
マイクロ環境の剛性は kilopascal の範囲で1ティッシュの培養皿の剛性が高いいくつかの注文の大きさとは対照的に軟組織の細胞が存在します。細胞外マトリックス蛋白質コーティング ソフト基板上のセルと初期実験を示した基板剛性が影響どのセル移動し同様、2、3の下に細胞外マトリックスに付着しています。実際には、基板の剛性は根本的に広汎性の生化学的なシグナルと同様の方法で細胞機能4を影響します。ポリアクリルアミドゲル (細胞外基質タンパク質でコーティング)、(水浸透) 細胞培養基板のメカノバイオロジー研究5として広く使用されているゲル。ポリジメチルシロキサン (PDMS)、最も一般的なシリコーン (ポリシロキサン)、広くとして使用されています硬いシリコン megapascal 範囲剛性を有するミクロン スケール製作6。さらに最近、柔らかいシリコーン基板もっと生理学的に関連する kilopascal の範囲の剛性は、メカノバイオロジー研究7,8細胞培養基板として採用されています。
原子間力顕微鏡、ストレッチ、レオロジー、およびインデントの使用球、球 microindentors9 をひっくり返した時に全てのサンプルの巨視的変形を含む、フレキシブル基板の剛性を測定するいくつかの方法が使用されています。.各テクニックには、独自の長所と短所がありますが、球とインデントはだけ広視野蛍光顕微鏡へのアクセスを必要とする特にシンプルでありながらかなり正確な方法です。金属球とインデントは前の仕事3,9,10でゲルの硬さを測定するために使用されています。基板剛性細胞運動の重要性を示した初期の作品には、ハイドロゲル基材剛性3を決定するこの方法が利用されています。最近では、共焦点顕微鏡は、エレガントな評価10で使用されています。
ここで、蛍光ビーズを結合ソフト シリコン基板を準備するためのステップ バイ ステップ プロトコルは提示 (とコラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白私)、上面にだけ位相イメージング インデント球とトップの表面を使用、蛍光イメージングは、それぞれ、そして最後には、シリコン基板のヤング率を計算する画像を解析します。この方法で準備、柔らかいシリコーン基板は、牽引力顕微鏡実験のために容易に使用できます。柔らかいシリコーンのベースとして (シャーレ) の代わりに硬いシリコンの使用外部ストレッチを用いたメカノバイオロジー研究ができます。ここで保証、起こりうる合併症を回避するために必要な実用的な考慮事項が示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
球圧子押込み法は簡単に実装できるは、圧子の選択と柔らかいシリコーン サンプルの厚さに注意を支払わなければなりません。ヤング率の計算に使用される式が条件11の下で有効で、圧子半径の > 10% シリコン サンプルの厚さは、通常これらが満たさと < ~ 圧子半径 x 13。圧子半径は前記試料の厚さが高すぎるではない、良い選択をされた 5-10 x のシリコーンの厚さがわかっ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マーガレット ・ ガルデルにありがとう寛大、レオメータの使用を許可します。我々 はこの作業を有効に NIH (1R15GM116082) からの支援を認めます。
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
