En flexibel lågpris hydroponiska System för bedömning av anläggningen Svaren till små molekyler i sterila förhållanden
Summary
En enkel, mångsidig och billig i vitro hydroponiska system optimerade framgångsrikt, aktivera storskaliga experiment under sterila förhållanden. Detta system underlättar tillämpningen av kemikalier i en lösning och deras effektiv absorption av rötter för molekylära, biokemiska och fysiologiska studier.
Abstract
Ett brett utbud av studier i växtbiologi utförs med hydroponiska kulturer. I detta arbete presenteras en in vitro- hydroponiska tillväxt system som utformats för att bedöma växt Svaren till kemikalier och andra ämnen av intresse. Detta system är mycket effektiva i att få homogena och friska plantor av C3 och C4 modell arter Arabidopsis thaliana och Setaria viridis, respektive. Steril odling undviker alger och mikroorganism förorening, som är kända begränsande faktorer för växternas normala tillväxt och utveckling i hydrokultur. Detta system är dessutom skalbar, så att skörden av växtmaterial i stor skala med mindre mekaniska skador, samt skörden av enskilda delar av en anläggning, om så önskas. Ett detaljerat protokoll som visar att detta system har en enkel och billig församling, som den använder pipetten rack som den huvudsakliga plattformen för odling av växter, tillhandahålls. Genomförbarheten av detta system har validerats med Arabidopsis plantor för att bedöma effekten av drogen AZD-8055, en kemiska hämmare av målet rapamycin (TOR)-Kinas. TOR hämning upptäcktes effektivt så tidigt som 30 min efter en AZD-8055 behandling i rötter och skott. Dessutom visas AZD-8055-behandlade växter den förvänta stärkelse-överskott fenotypen. Vi föreslog detta hydroponiska system som en idealisk metod för växt forskare som syftar till att övervaka effekten av växt-inducerare eller -hämmare, samt att bedöma metabola flöden använder isotop-märkning föreningar, som i allmänhet kräver användning av dyra reagenser.
Introduction
Fördelarna med odling av växter med hjälp av hydroponics har varit allmänt kända i produktion av stora och enhetliga växter, aktivera reproducerbara experiment1,2,3. I detta system, kan sammansättningen av nutritive lösningen kontrolleras ordentligt och återvunnet längs alla stadier i växternas tillväxt och utveckling. Dessutom utsätts rötter inte för abiotisk stress, som kan hända i jord-odlade växter, såsom näringsämne svält och vatten brist4. Som växter som odlas hydroponically närvarande morfologiska och fysiologiska egenskaper ganska liknande dem som odlade i jord, har detta system varit i stort sett anställd i forskningen eftersom den tillåter övervakning av root/skjuta tillväxt och deras skörd utan skador2,5.
På grund av möjligheten att ändra sammansättning och koncentration av nutritive lösning, forskningen använder hydroponiska villkor har genomförts för att karakterisera funktionerna av mikro- och makronäringsämnen1,3 ,6,7,8. Detta system har dock visat sig vara mycket användbar för ett brett spektrum av applikationer i växtbiologi, sådan att belysa funktioner hormoner och kemikalier i växter. Exempelvis upptäckten av strigolactones som en ny klass av hormoner9 och accelererad tillväxt fenotypen utlöses av brassinosteroid ansökan10 utfördes hydroponiska villkor. Dessutom, detta system gör experiment med märkta isotoper (t.ex., 14N /15N och 13CO2)11,12 att utvärdera deras införlivande i proteiner och metaboliter genom masspektrometri.
Som beaktar betydelsen av detta system i växtforskning, ett stort antal hydroponiska kulturer har utformats under de senaste åren, inklusive system som använder (i) överföringen av plantor från plåtar till hydroponiska behållare3, 13; (ii) rockwool som begränsar tillgången till de tidiga stadierna av roten utveckling2,14,15. (iii) polyeten granulat som flytande kroppen, vilket gör en enhetlig tillämpning av små molekyler/behandlingar svårt16; eller (iv) ett minskat antal växter9,17. Volymen av hydroponiska tankar beskrivs i många av dessa protokoll är vanligtvis stora (små volymer som sträcker sig från 1-5 L, upp till 32 L)18, vilket gör tillämpningen av kemikalier extremt dyrt. Även om några studier beskriver en hydroponiska odling under aseptiska förhållanden8,är19, montering av systemet oftast ganska mödosam, bestående av en perfekt anpassning av nylon maskor i plast eller glas behållare5,8,17,20.
På grund av betydelse Arabidopsis thaliana som en modell växt utformades flesta hydroponics system för denna art1,2,8,14,18, 19 , 20. ändå finns det några studier rapportering funktionerna hydroponiska tillväxt av andra växtarter med en förbehandling av frön för att förbättra sin grobarhet och synkronisering klassar in vitro8,16 . För att arbeta i stor skala, utvecklade vi ett protokoll för att inrätta ett enkelt och kostnadseffektivt underhåll hydroponiska system som möjliggör sterila förhållanden för odling av växter, inklusive A. thaliana och andra arter, såsom gräset Setaria viridis. Den metod som beskrivs här är lämplig för olika experiment, som fröplanta tillväxten kan vara maximerad, synkroniseras och enkelt övervakas. Dessutom detta system har många fördelar som: (i) dess montering är okomplicerad och dess komponenter kan återanvändas; (ii) det ger en lätt tillämpning av olika kemikalier i det flytande mediet; (iii) plantor gror och växer direkt i odlingsmediet utan behov av överföring till hydroponics system; (iv) skjuta och rot utveckling/tillväxt kan övervakas noga och plantorna skördas utan skador; och (v) det gör det möjligt att arbeta i stor skala, att upprätthålla fysiologiska förhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna optimerad hydroponiska struktur möjliggör framgångsrika i vitro kultur växter. Fröna gror bra på fasta mediet vid pipett tip platta ytan, en betydande vinst i jämförelse med system där fröna är indränkt med näringslösning. En stor fördel med detta system är att rötterna under plantan utveckling, få direkt kontakt med det flytande mediet utan behov av överföring. Dessutom kan kemisk behandling lätt tillämpas i det flytande mediet i en minskad volym. Fuktighet hålls hög, att undvika a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av de São Paulo Research Foundation (FAPESP; Bevilja 12/19561-0) och den Max Planck-sällskapet. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valeria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), och Viviane C. H. da Silva (uddar/CNPEM 24/2013) är tacksamma till stipendierna. Författarna vill tacka Christian Meyer från den Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankrike) för att generöst ge antikroppar mot RPS6. Författarna tackar RTV UNICAMP och Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel för deras tekniska support under audio inspelning.
Materials
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O., Asao, T. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. , 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W., Fleischer, S., Fleischer, B. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. 174, 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR?. Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
