Un flessibile a basso costo sistema idroponico per valutare le risposte della pianta a piccole molecole in condizioni sterili
Summary
Un sistema idroponico semplice, versatile e a basso costo in vitro è stato ottimizzato con successo, consentendo esperimenti su vasta scala in condizioni sterili. Questo sistema facilita l’applicazione di prodotti chimici in una soluzione e loro efficiente assorbimento dalle radici per studi molecolari, biochimiche e fisiologiche.
Abstract
Una vasta gamma di studi in biologia vegetale vengono eseguite utilizzando colture idroponiche. In questo lavoro, un sistema in vitro crescita idroponica progettato per valutare le risposte della pianta ai prodotti chimici ed altre sostanze di interesse è presentato. Questo sistema è molto efficiente nell’ottenere piantine omogenee sani della C3 e C4 modello specie Arabidopsis thaliana e Setaria viridis, rispettivamente. La coltura sterile evita alghe e contaminazione di microrganismi, che sono noti fattori limitanti per la normale crescita delle piante e lo sviluppo in coltura idroponica. Inoltre, questo sistema è scalabile, che permette la raccolta del materiale vegetale su larga scala con minori danni meccanici, come pure la raccolta di singole parti di una pianta se lo si desidera. Un protocollo dettagliato, dimostrando che questo sistema ha un montaggio facile e basso costo, in quanto utilizza pipetta rack come piattaforma principale per la coltivazione di piante, è fornito. La fattibilità di questo sistema è stata convalidata utilizzando piantine di Arabidopsis per valutare l’effetto del farmaco AZD-8055, un inibitore chimico del bersaglio della rapamicina (TOR) chinasi. L’inibizione di TOR è stato rilevato in modo efficiente più presto 30 min dopo un trattamento di AZD-8055 nelle radici e germogli. Inoltre, piante AZD-8055-trattati visualizzato il fenotipo di amido-eccesso previsto. Abbiamo proposto questo sistema idroponico come un metodo ideale per i ricercatori di impianto con l’obiettivo di monitorare l’azione della pianta induttori o inibitori, nonché valutare i cambiamenti continui metabolici utilizzando composti di marcatura a isotopi che, in generale, richiede l’uso di costosi reagenti.
Introduction
I vantaggi di usando la coltura idroponica coltivazione di piante sono state ampiamente riconosciuti nella produzione di impianti grandi e uniforme, consentendo esperimenti riproducibili1,2,3. In questo sistema, la composizione della soluzione nutritiva può essere adeguatamente controllata e riciclata lungo tutte le fasi della crescita delle piante e lo sviluppo. Inoltre, le radici non sono sottoposti a stress abiotici, come può accadere nelle piante coltivate in terreno, quali carenza di inedia e acqua nutriente4. Come piante coltivate idroponicamente presenti caratteristiche morfologiche e fisiologiche abbastanza simili a quelle coltivate in terreno, questo sistema è stato largamente impiegato nella ricerca perché permette il monitoraggio della crescita di radice/sparare e loro raccolta senza lesioni2,5.
Grazie alla possibilità di cambiare la composizione e la concentrazione della soluzione nutritiva, è stata eseguita la maggior parte della ricerca utilizzando condizioni idroponiche per caratterizzare le funzioni di micro – e macronutrienti1,3 ,6,7,8. Tuttavia, questo sistema ha dimostrato di essere molto utile per una vasta gamma di applicazioni in biologia vegetale, tali da delucidare le funzioni degli ormoni e sostanze chimiche nelle piante. Per esempio, la scoperta di strigolactones come una nuova classe di ormoni9 e il fenotipo di crescita accelerata innescato da Brassinosteroide applicazione10 sono stati effettuati in condizioni idroponiche. Inoltre, questo sistema permette di esperimenti con gli isotopi con etichettati (ad esempio, 14N /15N e 13CO2)11,12 per valutare la loro incorporazione in proteine e metaboliti mediante spettrometria di massa.
Considerando l’importanza di questo sistema nella ricerca della pianta, è stato progettato un elevato numero di colture idroponiche negli ultimi anni, compresi i sistemi che utilizzano (i) il trasferimento delle piantine da piastre a idroponici contenitori3, 13; (ii) rockwool che limita l’accesso agli stadi precoci della radice sviluppo2,14,15; (iii) Polietilene granulato come corpo galleggiante, che rende l’applicazione omogenea delle piccole molecole/trattamenti difficile16; o (iv) un ridotto numero di piante9,17. Il volume dei serbatoi idroponici descritto in molti di questi protocolli sono solitamente grandi (piccoli volumi che vanno da 1-5 L, fino a 32 L)18, che rende l’applicazione di sostanze chimiche estremamente costoso. Anche se alcuni studi descrivono una coltivazione idroponica sotto condizioni asettiche8,19, il montaggio dell’impianto è di solito abbastanza laborioso, costituito la perfetta regolazione di maglie di nylon in plastica o vetro contenitori5,8,17,20.
Data l’importanza di Arabidopsis thaliana come pianta modello, la maggior parte dei sistemi di coltura idroponica sono stata progettata per questa specie1,2,8,14,18, 19 , 20. Tuttavia, ci sono pochi studi che riferiscono le caratteristiche di crescita idroponica di altre specie di piante con un pretrattamento dei semi per migliorare la loro germinazione e sincronizzazione i tassi in vitro8,16 . Al fine di lavorare su larga scala, abbiamo sviluppato un protocollo per l’impostazione di un sistema idroponico di manutenzione semplice e a basso costo che consente condizioni di sterilità per la coltivazione di piante, tra cui a. thaliana e altre specie, come l’erba Setaria viridis. Il metodo qui descritto è adatto a diversi esperimenti, come la crescita del semenzale può essere ingrandita, sincronizzata e facilmente monitorata. Inoltre, questo sistema ha molti vantaggi come: (i) il suo montaggio è semplice e suoi componenti possono essere riutilizzati; (ii) permette la facile applicazione di diverse sostanze chimiche nel liquido di coltura; (iii) le piantine germinano e crescono direttamente nel terreno di coltura senza la necessità di transfert per il sistema di coltura idroponica; (iv) la crescita/sviluppo sparare e radice può essere strettamente sorvegliata e le piantine vengono raccolte senza danni; e (v) lo rende possibile lavorare su larga scala, mantenendo condizioni fisiologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa struttura di idroponica ottimizzata permette la cultura di successo in vitro di piante. Semi germinano bene sul mezzo solido alla superficie piana della punta di pipetta, un guadagno considerevole rispetto ai sistemi dove semi siano imbevuti di soluzione nutritiva. Un grande vantaggio di questo sistema è che durante lo sviluppo del semenzale, radici ottenere direttamente a contatto con il liquido di coltura senza la necessità di transfert. Inoltre, trattamento chimico può applicarsi facilmente nel liqu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione di ricerca di São Paulo (FAPESP; Concedere 12/19561-0) e la società Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), e vi sono grati per le borse di Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013). Gli autori ringraziano Christian Meyer dall’Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Francia) per generosamente fornendo anticorpi contro RPS6. Gli autori ringraziano RTV UNICAMP e Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza per il loro supporto tecnico durante l’audio registrazione.
Materials
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
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