分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導
Summary
白とベージュの脂肪細胞脂肪組織血管前駆細胞からの分化は、肥満の代謝改善の可能性を負いません。CD31 cd34 陽性 + + 人間の脂肪から内皮細胞分離および後続の in vitro拡張と白とベージュの脂肪細胞への分化のプロトコルについて述べる。いくつかのダウン ストリーム アプリケーションを説明します。
Abstract
肥満は脂肪細胞の肥大によって主に脂肪組織の大規模な改造を伴います。極端な脂肪細胞成長は、インスリン、ローカル低酸素症および炎症に悪い応答が返される前駆細胞から機能的な白い脂肪細胞の分化を刺激し、脂肪細胞の人口の根本的な肥大を防ぐことができるしの削減とともにその結果、脂肪代謝の健康を改善できます。炎症。また、ベージュ/ブラウンの脂肪細胞の分化を刺激しと、全身のエネルギー消費量を増やすことができる減量、その結果します。このアプローチは、肥満 2 型糖尿病と心血管疾患などの併存の開発を防ぐことができます。
本稿では、分離、拡張、および共同 CD31 と CD34 のマーカーを表現するひと脂肪組織の血管内皮細胞のサブセットから白とベージュの脂肪細胞の分化をについて説明します。メソッドは、比較的安価ですし、労働集約的ではないです。人間の脂肪組織へのアクセスを必要として皮下のデポはサンプリングに適しています。このプロトコルの新鮮な脂肪組織は、病的肥満者からサンプル [ボディマス指数 (BMI) > 35] 肥満手術の手順中に収集されます。間質血管の一部から順次 immunoseparation を使用して、十分な細胞は、脂肪の 2-3 g ほどから生成されます。これらの細胞文化 10-14 日間で拡大することがでくことができますが, 凍結保存、通路 5-6 まで継と、脂肪細胞のプロパティを保持します。細胞は、脂肪細胞の ppar γ アゴニスト ロシグリタゾンとヒトインスリンの組み合わせを使ってカクテルを 14 日間扱われます。
この方法は脂肪の血管内皮細胞、脂肪細胞応答を駆動する分子メカニズムに関する実験についての証明書を取得するため使用ことができますまたは、脂肪細胞を強化することができます新しい薬物をスクリーニングするため応答指示ホワイトのどちらかベージュ/ブラウン脂肪細胞分化。小さな皮下のバイオプシーを使用して、この手法を使用して肥満と併存の治療のためベージュ/茶色と白色脂肪細胞を刺激することを目的とする臨床試験のための非レスポンダー科目を画面できます。
Introduction
最近の証拠は、マウスとヒトでは、白またはベージュ/ブラウン脂肪1,2,3に脂肪組織の血管に存在するセルのサブセットを区別できますを示しています。このような細胞の表現型の中間表現型4,5,6、7のスペクトルや平滑筋/周皮細胞、血管内皮細胞を支持する証拠との論争の主題であります。この方法論の開発の範囲は、CD31 cd34 陽性 + + 肥満人間から別の脂肪質のターミナルから分離した内皮細胞の脂肪分化能をテストするためだった。文献の他の研究は、潜在的な合計の間質血管の分数または知られている脂肪細胞の前駆細胞の2,8,9の脂肪細胞に着目します。現在既存の技術は、薬配信10特に脂肪組織の血管内皮細胞をターゲットすることができますので、このような細胞の脂肪分化を受ける可能性を理解白またはベージュの脂肪細胞へ誘導重要です。将来の目標とされた療法。
別のグループは、ひと脂肪組織11,12,13から血管内皮細胞を分離するサロゲートとして CD31 と CD34 マーカーの組み合わせを報告しました。通常、2 つの連続した手順と磁気ビーズを用いた正の選択を使用して分離が実行されます。本報告では、CD31 プラスチック ビーズと組み合わせて CD34 陽性磁気ビーズを用いた immunoseparation に利用されました。典型的な石畳の内皮形態の保全に関して逐次磁気 immunoseparation に優れたこの手法がわかった。また、脂肪の 1-2 g ほどから始まって拡大と脂肪細胞の誘導に必要な十分な細胞を生成することができました。皮下脂肪の小さなサンプル生検は、下流用電池の必要な量を生成するのに十分です。この面は可能性のある重要な特に場合は、このメソッドは人間の脂肪分化誘導に対する反応性のスクリーニングに使用されます。
文献で報告された他のシステムとは異なり、この方法は CD31 cd34 陽性 + + 細胞の脂肪分化誘導のための 2 つの成分を利用: ppar γ アゴニスト-ロシグリタゾン — とヒトインスリンです。重要なは、インスリンの使用量は、人間14post-absorptive インスリンを循環通常/高の範囲内にあります。カクテルの誘導に対応する能力と、細胞の in vitro、Akt のリン酸化による測定のインスリンに対する反応性の程度は相関しなかった。興味深いことに、この誘導のカクテルや実験条件を使用して、白とベージュ/ブラウン細胞のミックスは、サイズと分子マーカーの発現と細胞内脂質液滴の数によって決定された得られました。(白とベージュ)、細胞の表現型の定量的評価と一緒にこの簡単かつコスト効果の高い誘導プロトコルは、差別化されたベージュのバランスを変更することができます潜在的エージェントのスクリーニング: 白色脂肪細胞です。
このメソッドは、ひと脂肪組織の血管内皮前駆細胞の脂肪細胞形成の基になるメカニズムを理解するためトランスレーショナル アプローチを提供します。この特定の分離/差別化手法を使用して、捜査官は様々 な経路の細く、肥満の人間の様々 な脂肪質のターミナルから血管内皮細胞のサブセットの脂肪細胞の形成を担当に問い合わせることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿の焦点は、分離、拡張および CD31 cd34 陽性 + + ひと脂肪組織内臓や皮下のデポから血管内皮細胞の脂肪分化誘導方法論を提供することです。
齧歯動物または CD31 抗体、蛍光ラベルまたは磁気ビーズ18,に結合を使用して主にテクニックを使って人間の様々 な血管ベッドから血管内皮細胞の隔離のための方法論が報告されています。<sup class="xref…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はベッキー マルケス、センタラ肥満センター、患者スクリーニングと同意のプロセスに彼女の援助のための医療コーディネーターを認識したいです。この研究は、Anca + Dobrian に R15HL114062 によって支えられました。
Materials
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Large Equipment |
|||
|
Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
|
Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
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|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
|
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
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|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
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|
ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
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|
Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
|
Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
|
Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
|
KRBSS Buffer |
|||
|
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
|
Tissue Digestion |
|||
|
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
|
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
|
Cell Isolation |
|||
|
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
|
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
|
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
|
Cell Culture |
|||
|
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
|
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
|
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
|
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
|
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
|
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
|
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
|
Cell Analysis |
|||
|
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
|
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
|
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
|
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
|
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
|
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
|
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
|
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
|
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
|
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
|
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
|
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
|
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
|
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
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