Bioprintable Alginate/gélatine Hydrogel 3D In Vitro systèmes modèles induisent la Formation de sphéroïde de cellule
Summary
Nous avons développé un modèle de cancer du sein hétérogènes constituées de cellules immortalisées de tumeur et fibroblastes incorporés dans un bioink d’alginate/gélatine bioprintable. Le modèle récapitule le microenvironnement de tumeurs in vivo et facilite la formation des sphéroïdes multicellulaires de tumeur, ce qui donne à comprendre les mécanismes conduisant la tumorigenèse.
Abstract
L’hétérogénéité cellulaire, biochimique et biophysique du microenvironnement tumeur native n’est pas récapitulée par croissant lignées de cellules cancéreuses immortalisé, à l’aide de culture cellulaire (2D) deux dimensions classiques. Ces problèmes peuvent être surmontés en utilisant des techniques bioprinting pour construire des modèles de tumeur (3D) en trois dimensions hétérogènes selon laquelle les différents types de cellules sont incorporés. Alginate et gélatine comptent parmi les plus courantes biomatériaux employés dans bioprinting en raison de leur biocompatibilité, “biomimétisme” et les propriétés mécaniques. En combinant les deux polymères, nous avons atteint un hydrogel composite de bioprintable avec des similitudes à l’architecture microscopique d’un stroma tumeur native. Nous avons étudié l’imprimabilité de l’hydrogel composite via rhéologie et obtenu la fenêtre d’impression optimale. Les fibroblastes et les cellules cancéreuses du sein ont été incorporés dans les hydrogels et imprimées pour former un modèle 3D imitant le microenvironnement in vivo . Le modèle hétérogène bioprinted réalise une grande viabilité pour la culture cellulaire à long terme (> 30 jours) et favorise l’auto-assemblage des cellules cancéreuses du sein en sphéroïdes multicellulaires tumeur (SCTM). Nous avons observé la migration et l’interaction des cellules fibroblastes associés au cancer (CAFs) avec le Centre des SCTM dans ce modèle. En utilisant les plates-formes de culture de cellules bioprinted comme des systèmes de co-culture, il offre un outil unique pour étudier la dépendance de la tumorigenèse sur la composition du stroma. Cette technique dispose d’un haut rendement, faible coût et haute reproductibilité, et il peut également fournir un modèle alternatif aux cultures monocouches de cellules classiques et des modèles animaux de tumeurs pour étudier la biologie du cancer.
Introduction
Bien que la culture de cellules 2D est largement utilisée dans la recherche sur le cancer, les limitations existent comme les cellules sont cultivées dans un format de monocouche avec une concentration uniforme de nutriments et d’oxygène. Ces cultures n’ont pas importante cellule-cellule et interactions cellule-matrice présent dans le micro-environnement de tumeur native (TME). Par conséquent, ces modèles mal récapitulent les conditions physiologiques, ce qui entraîne des comportements cellulaires aberrants, y compris les morphologies contre naturels, organisation de récepteurs irrégulière, polarisation de la membrane et l’expression des gènes anormaux, parmi d’autres conditions1,2,3,4. En revanche, la culture cellulaire 3D, où les cellules sont développées dans un espace volumétrique comme organoïdes, des agrégats ou des sphéroïdes, propose une autre technique pour créer des environnements in vitro plus précis afin d’étudier la physiologie et la biologie cellulaire fondamentale. Modèles de culture cellulaire 3D peuvent aussi encourager les interactions cellule-ECM qui sont critiques caractéristiques physiologiques de la native TME vitro1,4,5. La nouvelle technologie 3D bioprinting fournit des possibilités pour construire des modèles qui simulent la TME hétérogène.
Bioprinting 3D est dérivé de prototypage rapide et permet la fabrication de microstructures 3D qui sont capables d’imiter certaines des complexités de la vie des échantillons de tissus6,7. Les méthodes actuelles de bioprinting comprennent jet d’encre, d’extrusion et impression assistée par laser8. Parmi eux, la méthode d’extrusion permet l’hétérogénéité à être commandée dans les matrices imprimées en positionnant précisément des types distincts de matières à différents endroits initiales. Par conséquent, c’est la meilleure approche pour fabriquer hétérogènes en vitro modèles impliquant plusieurs types de cellules ou de matrices. Bioprinting extrusion a été utilisée avec succès pour construire les échafaudages en forme auriculaire9, structures vasculaires10,11,12et tissus13, résultant dans la cellule et de la haute fidélité d’impression de la peau viabilité. La technologie comporte également des sélections de matériel polyvalentes, la possibilité de déposer des matériaux avec des cellules intégrées avec une densité connue et une reproductibilité élevée14,15,16,17 . Les hydrogels naturels et synthétiques sont fréquemment utilisés comme bioinks pour 3D bioprinting en raison de leur biocompatibilité, bioactivité et leurs réseaux hydrophile qui peut être conçue pour ressemblent structurellement à l’ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Les hydrogels sont également avantageux puisqu’ils peuvent inclure des sites adhésifs pour les cellules, éléments structuraux, perméabilité d’éléments nutritifs et des gaz, et les propriétés mécaniques appropriées pour encourager les cellule développement24. Par exemple, hydrogels de collagène offre intégrine sites d’ancrage que les cellules peuvent utiliser pour attacher à la matrice. Gélatine, collagène dénaturé, conserve des sites similaires d’adhérence cellulaire. En revanche, l’alginate est bioinert mais fournit l’intégrité mécanique en formant des liaisons transversales avec les ions divalents25,26,27,28.
Dans ce travail, nous avons développé un hydrogel composite comme un bioink, composé d’alginate et de gélatine, avec des similitudes à l’architecture microscopique d’un stroma tumeur native. Les fibroblastes et les cellules cancéreuses du sein ont été incorporés dans les hydrogels et imprimé via un bioprinter axée sur l’extrusion pour créer un modèle 3D qui imite le microenvironnement in vivo . L’ingénierie environnement 3D permet de cellules cancéreuses former des sphéroïdes multicellulaires tumeur (SCTM) avec une grande viabilité pendant de longues périodes de culture cellulaire (> 30 jours). Ce protocole illustre les méthodes de synthèse composites hydrogels, qui caractérisent la microstructure des matériaux et une imprimabilité, bioprinting cellulaires modèles hétérogènes et observer la formation des SCTM. Ces méthodes peuvent s’appliquer à autre bioinks en extrusion bioprinting aussi bien quant aux desseins de différents modèles de tissus hétérogènes avec des applications potentielles dans le dépistage des drogues, essais de migration des cellules et des études qui mettent l’accent sur la cellule fondamentale fonctions physiologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les structures chargées de cellule peuvent être compromises en cas de contamination (biologique ou chimique) à tout moment dans le processus. Habituellement, la contamination biologique est vu après deux ou trois jours de la culture comme une couleur changer dans les milieux de culture ou de la structure bioprinted. La stérilisation (physique et chimique de désinfection) est donc une étape clé pour tous les processus liés à la cellule. Remarquable, gélatine d’autoclavage modifie ses propriétés gélifiantes…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tao Jiang Merci le China Scholarship Council (201403170354) et la bourse doctorale ingénierie de McGill (90025) pour leur financement de bourses d’études. Jose G. Munguia-Lopez Merci CONACYT (250279, 290936 et 291168) et FRQNT (258421) pour leur financement de bourses d’études. Salvador Flores-Torres Merci CONACYT pour leur bourse financement (751540). Joseph M. Kinsella Merci le National Science and Engineering Research Council, la Fondation canadienne pour l’Innovation, Townshend-Lamarre Family Foundation et l’Université McGill pour leur financement. Nous tenons à remercier Allen Ehrlicher de nous permettre d’utiliser son rhéomètre, Dan Nicolau de nous permettre d’utiliser son microscope confocal et Morag Park pour nous accorder l’accès aux lignées cellulaires fluorescent étiquetés.
Materials
| Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
| Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
| Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ water | Millipore | N/A | |
| Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
| Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
| Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
| Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
| Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
| Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
| 3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
| 10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
| End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
| Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
| Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Water bath | VWR | N/A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
| Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
| Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
| Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
| Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
| CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
| MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
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