組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団
Summary
一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically 分子細胞集団を特徴付けます。
Abstract
肺浸潤の評価と分子解析長い不均一性を表し、明確な細胞集団を定義に使用されています。FACS は本質的に単一セルの試金、しかし分子解析する前に、標的細胞は、一括で分離されたよく前向き単一セルの解像度を失うこと。単一細胞の遺伝子発現解析は、異種細胞集団の個々 のセルの分子の違いを理解するための手段を提供します。一括細胞分析で異なる細胞型の overrepresentation 結果バイアスと希少な細胞からの信号の咬合の生物学的重要性。FACS インデックス並べ替え結合した単一細胞遺伝子発現解析を活用することにより集団調査できる単一セルの解像度の損失なし中間細胞表面マーカーの発現と細胞もキャプチャされます, 中の評価を有効にします。連続表面マーカー発現の関連性。ここでは、逆のトランスクリプションの単一セルを組み合わせたアプローチについて述べる定量的 PCR (RT qPCR) および FACS インデックスを同時に分子を特徴付ける並べ替えおよび細胞集団内で肺浸潤の不均一性。
単一細胞 RNA 配列方法と対照をなして特定のターゲットの増幅と qPCR を使用少ない落ちこぼれで低豊富な転写産物の堅牢な測定のためにはしない読み取りの細胞間の変動に関連する問題によって混同される中深さ。また、直接インデックス並べ替え単一セル換散には、このメソッドをバッファーにより cDNA を合成して特定のターゲット中古増幅の細胞表面で分子の署名の後派生の相関に関しては同様に 1 つのステップで実行するにはマーカー式。造血の単一細胞を調べるのにも他のセルタイプで正常に使用されている記述方法をしました。
結論としては、記載方法は明確な分子集団のそれに続く分離のためのプロトコルを開発するパネルの可能性は、事前に選択された遺伝子の mRNA 発現の高感度に測定できます。
Introduction
それぞれ個々 の白血球細胞が幹細胞が最終的に末期特定を運ぶ最終的なエフェクター細胞に分化ますますコミットの中間の前駆細胞の一連の上に頂点を形成、細胞の階層内に存在すると考えられています。生体機能1。幹細胞システムの構成方法に関する知識の多くは前向きの高濃縮幹細胞や前駆細胞様々 な2 異なる造血集団を切り離すことができるため主造血系で発生しています。FACS を並べ替えています。これが分析する機能や分子、主に遺伝子発現プロファイリング3,4を介してこれらの人口の多くはできました。ただし一括集団個体差細胞の遺伝子発現解析は、平均し、5を失った。したがって、異種細胞内細胞の変化を検出する無能を混同するかもしれない重要な生物学的プロセスの私達の理解場合細胞の小さなサブセットは、人口6の推定される生物学的機能の 7。逆に、単一セルの解像度で遺伝子発現シグネチャの調査は、不均一性を表し、セル8のあるサブセットから覆っの影響を回避する可能性を提供しています。
日付 1 細胞遺伝子発現解析のための多くのプロトコルが開発されました。それぞれの方法で、独自の注意事項があります。最も早い方法であった RNA 蛍光その場で交配 (RNA-魚)、一度に転写産物の限られた数を測るが、RNA 局在9,11の調査のことでユニークです。単一または非常に少数の成績証明書も検出する PCR と qPCR 使用初期の方法は、12を開発しました。ただし、これらが最近交換済み qPCR を通して細胞の何百もの細胞 1 個あたりの成績の何百もの式を同時に分析でき、したがって高次元不均一性解析の使用を許可するマイクロ流体法によるあらかじめ決められた遺伝子パネル10,13。最近 RNA シーケンス技術普及して単一細胞解析、これらは理論的にセルの全体のトランスクリプトームを測定することができ、それにより不均一性解析10、に探索的次元を追加14. 多重 qPCR 解析と単一細胞 RNA シーケンスが異なる機能を持っている、従ってメソッドのいずれかを使用するための理論的根拠はターゲット人口のセルの数だけでなく、質問に決まります。高スループットと単一細胞 RNA シーケンスの公平な探索特性と共にセルあたりの低コストは、不明なセルまたは大規模な集団を調査したときに望ましいです。ただし、単一細胞 RNA シーケンスは低豊富で成績証明書が脱落しやすいより頻繁高い豊富な成績証明書のシーケンスに偏っても。これはバイオ情報解析は、しばしば微妙なや技術的ノイズ15に隠された重要なの分子シグナルを明らかにするために高需要を置くかなり複雑なデータにつながることができます。したがって、よ特徴付けられた組織の単一セル qPCR による解析済みプライマー パネルの機能的に重要な遺伝子や分子マーカーの選択することができますの不均一性を決定するための敏感な簡単なアプローチとして、人口。しかし、それは比較するに注意する必要があります単一細胞 RNA シーケンス、セルあたりのコストが単一セル qPCR 法一般的に高くなっています。ここでは、単一セル Rt-qpcr (Teles J.らから変更を組み合わせたアプローチについて述べる16)、FACS インデックスに集団内で分子と肺浸潤の不均質性を特徴付けるために17バイオインフォマティクス解析18を同時に並べ替え。
このアプローチで興味の細胞を染色すると、単一セルは、96 ウェル PCR プレートの換散バッファーに直接 FACS によって並べ替えられます。同時に、細胞表面マーカーの追加セットの表現のレベルは、FACS-並べ替え、インデックス並べ替えと呼ばれますメソッド中に単一セルごとに記録されます。物質分離細胞は増幅されその後、RT qPCR、マイクロ流体プラットフォームを使用して、選択した一連の遺伝子の遺伝子発現分析します。この方法により、個々 のセルのセル表面のマーカー式の並べ替えられた同時と同様シングル セル特性の分子分析です。細胞の分子特定サブセットをインデックス付きの並べ替えられたマーカーの発現に直接マップによって subpopulations は、将来の分離に使用できます特定イムノフェノ タイプにリンクできます。メソッドの説明図 1で一歩一歩。微妙な遺伝子式信号を見えなくことができますそれ以外の場合は無関係の豊富な遺伝子の測定を回避できますので、さらにパネルであらかじめ決められた遺伝子は目標とされた遺伝子の表現のより高い解像度に貢献します。さらに、特定のターゲットの増幅、1 つのステップの逆のトランスクリプションおよび増幅できます低表現された成績証明書、転写因子や非ポリ adenylated Rna のような堅牢な測定。重要なは、qPCR 法19特定の悪性疾患を調査するときに重要である融合蛋白質から mRNA の測定を可能にします。最後に、遺伝子の数は集中を調査した、低ドロップ アウト率と単一細胞 RNA シーケンスより高い次元のメソッドと比較して限られた細胞をこのメソッドを簡単に分析した技術的な差プロトコルに従うことによって実験全体から実行できます、このシンプルで簡単な高感度、高スループットの単一細胞遺伝子発現解析法を作って 3 日以内、分析結果にセルを並べ替えします。
Protocol
Representative Results
Discussion
近年では、1 細胞遺伝子発現解析は様々 な細胞集団23の不均一性を定義する貴重な追加になりました。RNA シーケンス テクノロジーの出現は、しかし、これらのメソッドは、セルのセル配列の深さやドロップ アウトの変化によって複雑な理論的にセルの全体のトランスクリプトームを測定する可能性を提供します。何百ものすべてのセルが重要な遺伝子の発現の敏感でロバ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事、医学研究、スウェーデン小児がん財団、ラグナル協会財団と、クヌートとアリス バレンベリー財団でスウェーデンの癌協会、スウェーデン研究評議会、スウェーデン会からの助成金によってサポートします。
Materials
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
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| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
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| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
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| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
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