Комбинаторные одноклеточных подход к характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность человеческих стволовых и прогениторных населения
Summary
Основная ген выражение измерения облако отдельной ячейки различия в гетерогенных клеточных популяций. Здесь мы описываем протокол для анализа выражения гена как одноклеточных и индекс Сортировка по цветения активирован ячейку Сортировка (FACS) могут быть объединены для разграничения неоднородность и immunophenotypically характеризуют молекулярно различных клеточных популяций.
Abstract
Иммунофенотипический характеристика и молекулярный анализ давно использовались для разграничения неоднородность и определить собственный клеточных популяций. СУИМ относится по своей сути одноклеточных, однако до молекулярного анализа, клетки-мишени часто проспективно изолированы навалом, тем самым теряя резолюции одноклеточных. Анализ выражения гена одноклеточных предоставляет средства для понимания молекулярные различия между отдельными ячейками в гетерогенных клеточных популяций. В массового анализа клеток завышается типа отдельных клеток приводит к предубеждения и окклюзий сигналов от редких клеток с биологической важности. Путем использования СУИМ индекс сортировки в сочетании с анализ выражения гена одноклеточных, населения могут быть исследованы без потери одной ячейки резолюции в то время как клетки с поверхности маркер выражения промежуточные клетки также регистрируются, включение оценки актуальность непрерывной поверхности маркер выражения. Здесь мы опишем подход, сочетающий одной ячейки обратной транскрипции количественного PCR (RT-ПЦР) и СУИМ индекс сортировки одновременно характеризовать молекулярных и иммунофенотипических гетерогенность в популяции клеток.
В отличие от одноклеточного РНК последовательности методов использование ПЦР с конкретной цели усиления позволяет для надежного измерения низкой изобилие стенограммы с меньшим количеством отсева, в то время как она не confounded, вопросы, связанные с вариациями для ячеек в чтение глубины. Кроме того непосредственно индекс сортировка сингл клетки в лизис буфер этот метод, позволяет для синтеза cDNA и конкретных целевых предварительного усиления выполнить за один шаг, а что касается корреляции впоследствии производных молекулярной подписей с клеточной поверхности маркер выражения. Описанный подход был разработан для расследования гемопоэтических сингл клетки, но также успешно используются на других типах клеток.
В заключение подход, описанный в настоящем документе для чувствительных измерения mRNA выражение для группы предварительно отобранных генов с возможностью позволяет разрабатывать протоколы для последующих потенциальных изоляции молекулярно отдельных субпопуляций.
Introduction
Каждой отдельной клетки крови, как считается, проживают в клеточном иерархии, где стволовые клетки формируют Апекс поверх ряда все более совершенные промежуточных прародителей, которые в конечном итоге неизлечимо дифференцироваться в окончательный эффекторные клетки, несущие конкретных биологические функции1. Большая часть знаний о том, как организованы стволовых клеток систем был создан в системе кроветворения, во многом из-за способность перспективно изолировать отдельных гемопоэтических населения высокообогащенного стволовых клеток или различных прародителей2 сортируя СУИМ. Это позволило для многих из этих групп населения будут проанализированы функционально или молекулярно, преимущественно через выражение гена профилируя3,4. Однако когда анализ экспрессии генов сыпучих населения индивидуальных различий между ячейками усредняются и потерял5. Таким образом невозможности выявления отклонений в ячейке в гетерогенных клеток фракций может посрамить нашего понимания важнейших биологических процессов, если малого подмножества ячеек для выводимого биологические функции этого населения6, 7. И наоборот расследование подписей выражение генов в одной ячейки резолюции предлагают возможность разграничить неоднородность и обойти затмевает влияний из перепредставленных подмножеств клетки8.
На сегодняшний день были разработаны многие протоколы для анализа выражения гена одной ячейки; с каждым подходом, имея свой собственный предостережений. Метод ранней был РНК флуоресцентные в situ гибридизация (РНК-рыба), который измеряет ограниченное количество стенограммы в то время, но является уникальным в том, что она позволяет для исследования РНК локализации9,11. Ранние методы, с помощью ПЦР и ПЦР для выявления одного или немногих стенограммы были также разработаны12. Однако они в последнее время были заменены на основе микрофлюидика методы, которые можно одновременно анализировать выражение сотни стенограммы на ячейку в сотни клеток через ПЦР и таким образом позволяют для высоких мерного неоднородность анализ с помощью предопределены гена панелей10,13. Недавно РНК последовательности-технологии на основе стали широко использовали для анализа одной ячейки, как теоретически можно измерить всю транскриптом клетки и таким образом добавить произвольное измерение неоднородность анализа10, 14. Multiplexed ПЦР анализ и одноклеточного РНК последовательности имеют разные функции, таким образом обоснование с использованием любого из методов зависит вопрос, а также количество клеток в целевой популяции. Высокой пропускной способностью и низкой стоимости в клетку вместе с беспристрастной, исследовательские характеристики сингл клеточной РНК последовательности желательно, когда расследование неизвестной клетки или больших групп населения. Однако сингл клеточной РНК последовательности также предвзято к виртуализации высокой обильные стенограммы чаще пока стенограммы с низкой изобилие подвержены отсева. Это может привести к значительно сложных данных, которые ставит высокий спрос на bioinformatic анализ, чтобы выявить важные молекулярных сигналов, которые часто тонкие или скрытые в технических шума15. Таким образом, для хорошо изученных тканях, одной ячейки ПЦР анализ с использованием заранее грунтовка панелей, отобранных для функционально важно генов или молекулярных маркеров может служить в качестве чувствительных, простой подход, чтобы определить неоднородности населения. Однако, следует отметить, что по сравнению с одной ячейкой РНК seq, стоимость ячейки как правило, выше для одной ячейки ПЦР методов. Здесь мы опишем подход, сочетающий одноклеточных RT-ПЦР (изменение от Телеш J. et al. 16), СУИМ индекс сортировки17 и биоинформатики анализ18 для того чтобы одновременно характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность населения.
В этом подходе окрашенных клеток населения интерес, и одного клетки отсортированы по СУИМ непосредственно в буфер lysis в 96-луночных ПЦР планшетов. Одновременно выражение уровни дополнительного набора маркеров клетк поверхности записываются для каждой одной ячейки во время СУИМ сортировка, метод, который называется индекс сортировка. Лизированных клеточный материал впоследствии усиливается и экспрессии генов выбранного набора генов, проанализированы с RT-ПЦР, используя microfluidic платформа. Эта стратегия позволяет молекулярный анализ отсортированный одноклеточных, а также одновременное характеристика каждой отдельной ячейки клетк поверхности маркер выражения. Непосредственно сопоставив молекулярно различные подмножества ячеек в выражение индексированных маркеров отсортированный, субпопуляции могут быть связаны с конкретной иммунофенотип, который может использоваться для их будущих изоляции. Описан метод шаг за шагом на рисунке 1. Заранее гена Группа далее способствует более высоким разрешением экспрессии целевых генов, поскольку он обходит измерения не значения обильные генов, которые в противном случае может загородить тонкие ген выражение сигналов. Кроме того конкретные цели усиления, один шаг обратной транскрипции и усиления позволяет для надежного измерения низким выраженным стенограмм, как факторы транскрипции или не поли adenylated РНК. Важно отметить, что ПЦР методы позволяют для измерения mRNA от синтез белков, которые имеют важное значение при расследовании некоторых злокачественных заболеваний19. Наконец расследование целенаправленных количество генов, низкий процент отсева, и ограниченные технические различия между клетки делают этот метод легко проанализированы по сравнению с выше размеров методы, такие как сингл клеточной РНК seq. В соответствии с протоколом, может выполняться эксперимент всего, от сортировки клеток проанализированы результаты, в течение трех дней, что делает это простой и быстрый метод для чувствительной, высок объём одноклеточных гена выражения анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
В последние годы анализ выражения гена одной ячейки стал ценным дополнением для определения неоднородности популяций различных клеток23. Появление РНК последовательности технологий теоретически обеспечивает возможность измерить всю транскриптом ячейки, однако эти мето…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается грантов от шведского общества рака, Шведский исследовательский совет, Шведское общество для медицинских исследований, Шведский фонд детства рака, Рагнар Söderberg фонд и кнут и Фонд Рауля Валленберга Алиса
Materials
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
- Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
- Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
- Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
- Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
- Tung, P. -. Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
- Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
- Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
- de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
- . indexed-sorting Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016)
- Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
- Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
- Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
- Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
