Expression et Purification des canaux ioniques de mammifères Bestrophin
Summary
La purification des canaux ioniques est souvent difficile, mais une fois atteint, il peut potentiellement permettre in vitro les enquêtes des fonctions et des structures des canaux. Nous décrivons ici les procédures pas à pas pour l’expression et purification des protéines de mammifères bestrophin, une famille de Ca2 +-activé les canaux Cl– .
Abstract
Le génome humain code pour quatre bestrophin paralogues, nommément BEST1, BEST2, BEST3 et BEST4. Best1, codée par le gène BEST1 , est un Ca2 +-activé Cl– canal (CaCC) principalement exprimée dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE). La signification physiologique et pathologique de BEST1 est mis en évidence par le fait que plus de 200 mutations différentes du gène BEST1 ont été génétiquement liées à un éventail d’au moins cinq troubles dégénératifs rétiniens, comme meilleur Vitelliforme Dystrophie maculaire (meilleure maladie). Par conséquent, comprendre la biophysique des canaux de bestrophin à l’échelle de la molécule unique est titulaire d’importance considérable. Cependant, obtenir des canaux ioniques mammifères purifiée est souvent une tâche difficile. Nous rapportons ici un protocole pour l’expression des protéines de mammifères bestrophin avec le système de transfert de gène de baculovirus BacMam et leur purification par affinité et chromatographie d’exclusion stérique. Les protéines purifiées ont le potentiel d’être utilisé dans les analyses subséquentes fonctionnelles et structurelles, telles que l’enregistrement électrophysiologique dans les bicouches lipidiques et cristallographie. Ce qui est important, ce pipeline peut être adapté pour étudier les fonctions et les structures d’autres canaux ioniques.
Introduction
Bestrophins sont une famille de canaux ioniques conservés par espèces variant de bactéries à l’homme1. Chez l’homme, le gène BEST1 , situé sur le chromosome 11q12.3, code pour la protéine de la membrane Bestrophin-1 (BEST1) qui s’exprime principalement dans la membrane basolatérale des cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien des yeux2,3 ,4. Composé de 585 acides aminés, la première ~ 350 qui sont hautement conservées entre les espèces et contenir sa région transmembranaire, BEST1 agit comme un CaCC dans les humains1,5,6. En outre, les homologues BEST1 chez les poulets et Klebsiella pneumoniae à la fois fonctionnent comme homopentamers7,8, ce qui suggère un niveau élevé de conservation tout au long de l’évolution.
Chez l’homme, plus de 200 mutations du gène BEST1 ont été cliniquement liées à un groupe de maladies de dégénérescence rétinienne appelé bestrophinopathies1,9. Cinq bestrophinopathies spécifiques ont été signalés, notamment maladie de Best, dystrophie Vitelliforme de l’adulte, autosomique dominante vitreoretinochoroidopathy, autosomique récessive bestrophinopathy et rétinite pigmentaire3,4 ,10,11,12,13,14. Ces maladies, qui conduisent à une diminution de la vue et même la cécité, sont actuellement incurables. Afin de développer des traitements thérapeutiques et médicaments potentiellement personnalisés, il est essentiel de comprendre comment ces mutations pathogènes de BEST1 influencent la fonction et la structure des BEST1 canal15. À ces fins, les chercheurs doivent obtenir des canaux bestrophin purifié (souche sauvage et/ou mutant) et conduite in vitro analyses5,8.
La première étape clée est l’expression des canaux bestrophin des espèces plus élevées dans les cellules de mammifères. Comme baculovirus transduction des cellules HEK293-F (système BacMam) est une méthode puissante pour exprimer façon hétérologue protéines de membrane16,17, ce protocole utilise un vecteur de BacMam (pEG BacMam) optimisé pour expression robuste de la cibler les protéines18, dans ce cas, qui est un homologue de bestrophin chez les mammifères. Ce vecteur a été utilisé pour l’expression de diverses protéines de membrane, y compris des récepteurs couplés aux protéines G, récepteurs nucléaires et autres de canaux d’ion18. Il semble également que les protéines produites sont adaptés pour la cristallographie18. Avec des niveaux élevés d’expression dans les cellules HEK293-F, les protéines peuvent alors être épurées chromatographie ; plus précisément, dans le cas de bestrophins, affinité et chromatographie liquide d’exclusion peuvent être utilisés.
Une fois que ce protocole est affiné pour une chaîne de bestrophin, la protéine purifiée puis peut être analysée que pour sa fonction et sa structure à travers la bicouche lipidique plane et cristallographie de rayon x, respectivement de5,8. Au total, ces techniques offrent un pipeline puissant pour les études fonctionnelles et structurelles des bestrophins et d’autres canaux ioniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit un pipeline utile pour l’expression et purification des canaux ioniques bestrophin mammifère à être utilisé pour des analyses futures in vitro . Alors que l’appareil FPLC est nécessaire pour la chromatographie d’exclusion stérique, un pousse-seringue est suffisante pour toutes les étapes de la chromatographie d’affinité y compris contraignantes, lavage et d’élution. Lorsque vous utilisez une pompe à seringue pour pousser des solutions (dans une seringue) à travers une co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par le NIH subventions EY025290, GM127652 et University of Rochester fonds de démarrage.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
