Uttryck och rening av däggdjur Bestrophin jonkanaler
Summary
Rening av jonkanaler är ofta utmanande, men när uppnått, det potentiellt kan tillåta in vitro- undersökningar av funktioner och strukturer av kanalerna. Här, vi beskriver stegvis förfarandena för uttryck och rening av däggdjur bestrophin proteiner, en familj av Ca2 +-aktiverade Cl– kanaler.
Abstract
Det mänskliga genomet kodar fyra bestrophin paralogs, nämligen BEST1, BEST2, BEST3 och BEST4. BEST1, kodas av genen BEST1 , är en Ca2 +-aktiverade Cl– kanal (CaCC) huvudsakligen uttryckt i pigmentepitelet (RPE). BEST1 fysiologiska och patologiska betydelse understryks av det faktum att över 200 olika mutationer i BEST1 -genen har varit genetiskt kopplade till ett spektrum av minst fem retinala degenerativa sjukdomar, såsom bästa vitelliform makula dystrofi (bästa sjukdom). Därför innehar förstå biofysisk bestrophin kanaler på singel-molekyl nivå oerhörd betydelse. Att erhålla renat däggdjur jonkanaler är dock ofta en utmanande uppgift. Vi rapporterar här, ett protokoll för uttrycket av däggdjur bestrophin proteiner med BacMam baculoviridae gen transfersystemet och deras rening av affinitet och storlek-utslagning kromatografi. De renade proteinerna har potential att utnyttjas i efterföljande funktionella och strukturella analyser, såsom elektrofysiologiska inspelning i lipid lipidmonolager och kristallografi. Viktigast av allt, kan denna rörledning anpassas att studera de funktioner och strukturer av andra jonkanaler.
Introduction
Bestrophins är en familj av jonkanaler bevarad genom arter varierar mellan bakterier och människa1. Hos människa kodar genen BEST1 , belägen på kromosom 11q12.3, proteinet membran Bestrophin-1 (BEST1) som uttrycks huvudsakligen i basolateral membranet av retinal pigment epitel (RPE) celler av ögon2,3 ,4. Består av 585 aminosyror, de första ~ 350 som bevaras mycket bland arter och innehåller sin transmembrana region, fungerar BEST1 som en CaCC människor1,5,6. Dessutom fungera både de BEST1 homologs hos kycklingar och Klebsiella pneumoniae som homopentamers7,8, vilket tyder på en hög nivå av bevarande under hela evolutionen.
I människor, har över 200 mutationer i BEST1 -genen varit kliniskt kopplade till en grupp näthinneförtvining sjukdomar kallas bestrophinopathies1,9. Fem specifika bestrophinopathies har rapporterats, inklusive bästa sjukdom, vuxen ålder vitelliform dystrofi, autosomalt dominerande vitreoretinochoroidopathy, autosomalt recessiv bestrophinopathy och retinitis pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Dessa sjukdomar, som leder till nedsatt syn och med blindhet, är för närvarande icke behandlingsbar. För att utveckla terapeutiska behandlingar och potentiellt personlig medicin, är det viktigt att förstå hur dessa BEST1 sjukdomsframkallande mutationer påverka funktion och struktur av BEST1 kanal15. För dessa ändamål behöver forskare erhålla renat bestrophin (vildtyp eller mutant) kanaler och driva in vitro- analyser5,8.
Det första viktiga steget är ett uttryck för bestrophin kanaler från högre arter i däggdjursceller. Baculoviridae transduktion HEK293-F celler (BacMam system) är en kraftfull metod att heterologously uttrycka membranet proteiner16,17, detta protokoll använder tredjeparts en optimerad BacMam vektor (pEG BacMam) robust uttryck för den mål protein18, som i detta fall är ett däggdjur bestrophin homolog. Denna vektor har använts av uttryck för olika membranproteiner, inklusive G-proteinkopplade receptorer, nukleära receptorer och andra ion kanaler18. Det finns också bevis för att de producerade proteinerna är lämplig för kristallografi18. Med höga nivåer av uttryck i HEK293-F celler, kan proteiner sedan renas med hjälp av kromatografi; särskilt när det gäller bestrophins, kan både affinitet och storlek-utslagning kromatografi användas.
När detta protokoll är finjusterad för en bestrophin kanal, kan renat protein sedan analyseras för dess funktion och struktur genom planar lipid lipidens och röntgenkristallografi, respektive5,8. Dessa tekniker ger sammantaget en kraftfull rörledning för funktionella och strukturella undersökningar av bestrophins och andra jonkanaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver en användbar rörledning för uttryck och rening av däggdjur bestrophin jonkanaler som ska användas för framtida in vitro- analyser. Medan FPLC enheten krävs för storlek-utslagning kromatografi, är en sprutpump tillräcklig för alla steg i affinitetskromatografi inklusive bindande, tvätt och eluering. När du använder en sprutpump till push lösningar (i en spruta) genom en kolonn, är det viktigt att underfång våren sidan för att undvika att trycka in luftbubblor i ko…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har finansierats av NIH grants EY025290, GM127652 och University of Rochester startfinansiering.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
