استخدام البروتينات النووية الذاتية من الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج بالانزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن co لدراسة البروتين-بروتين التفاعلات بين البروتينات النووية الذاتية تحت ظروف التاكسج. هذا الأسلوب مناسبة للمظاهرة للتفاعلات بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك في نقص.
Abstract
مستويات الأوكسجين المنخفضة (نقص) يؤدي إلى مجموعة متنوعة من استجابات التكيف مع عامل نقص إيندوسيبلي 1 (منطقياً-1) معقدة تعمل كمنظم رئيسي. منطقياً-1 تتألف من وحدة فرعية α تنظم الأكسجين هيتيروديميريك (كحلول’-1α) ومؤثراً أعرب عن الوحيدات بيتا (منطقياً-1β) يعرف أيضا باسم أريل هيدروكربون مستقبلات النووية ترانسلوكاتور (ارنت)، تنظيم الجينات المتورطين في عمليات متنوعة بما في ذلك الأوعية ، تكون الكريات الحمر وتحلل. تحديد البروتينات المتفاعلة منطقياً-1 مفتاح لفهم نقص إشارات الطريق. إلى جانب تنظيم الاستقرار 1α منطقياً، يؤدي نقص أيضا إزفاء النووية للعديد من عوامل النسخ بما في ذلك 1α سكانية وارنت. جدير بالذكر أن معظم الأساليب الحالية المستخدمة لدراسة هذه التفاعلات البروتين-بروتين (القياسية) تستند إلى نظم حيث يتم زيادة مستويات البروتين مصطنع من خلال أوفيريكسبريشن البروتين. بروتين أوفيريكسبريشن وكثيراً ما يؤدي إلى نتائج غير الفسيولوجية الناجمة عن التحف الزماني والمكاني. هنا يصف لنا co-إيمونوبريسيبيتيشن تعديل البروتوكول بعد علاج نقص استخدام البروتينات النووية الذاتية، و كدليل على المفهوم، لإظهار التفاعل بين 1α سكانية وارنت. في هذا البروتوكول، كانت تحصد الخلايا التاكسج تحت ظروف التاكسج ودولبيكو المخزن المؤقت ليغسل المالحة فوسفاتيبوفيريد (دببس) كان أيضا قبل متوازن لظروف التاكسج قبل الاستخدام للتخفيف من حدة تدهور البروتين أو بروتين معقد الانفصال من خلال ريوكسيجينيشن. وباﻹضافة إلى ذلك، استخرجت الكسور النووية في وقت لاحق إلى التركيز واستقرار البروتينات النووية الذاتية وتجنب نتائج زائفة ممكن غالباً ما ينظر خلال overexpression البروتين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإظهار التفاعلات الذاتية وأصلي بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك تحت ظروف التاكسج.
Introduction
نقص يحدث عندما يتم تزويد عدم كفاية الأكسجين إلى الخلايا والأنسجة في الجسم. أنها تلعب دوراً حاسما في مختلف العمليات الفسيولوجية والباثولوجيه مثل تمايز الخلايا الجذعية، التهاب وسرطان1،2. بمثابة عوامل نقص إيندوسيبلي (التنظيم) heterodimers تتألف من وحدة فرعية α الأكسجين وينظم ووحدة فرعية β أعرب مؤثرا المعروف أيضا ارنت3. وقد حددت isoforms ثلاث مفارز منطقياً-α (منطقياً-1α، 2α سكانية ومنطقياً-3α) وثلاث مفارز منطقياً-β (ارنت/منطقياً-1β و ARNT2 و ARNT3) حتى الآن. هي أعربت 1α سكانية وارنت أوبيكويتوسلي، بينما 2α سكانية ومنطقياً-3α و ARNT2 و ARNT3 وقيدت أكثر أنماط التعبير4. البروتين 1 سكانية معقدة هي الجهة الرئيسية لنقص استجابة. تحت ظروف التاكسج، 1α سكانية يصبح استقرت، ثم translocates إلى النواة وديميريزيس مع ارنت5. في وقت لاحق، هذا المجمع بربط النيوكليوتيدات المحددة المعروفة بنقص استجابة عناصر (HREs) وينظم الجينات المستهدفة المتورطين في عمليات متنوعة بما في ذلك الأوعية، وتكون الكريات الحمر وتحلل6. وبالإضافة إلى هذا الرد “المتعارف عليه”، مسار مما يشير إلى نقص كما هو معروف للحديث المتبادل مع الاستجابة الخلوية متعددة مما يشير إلى مسارات مثل الشق والنووي كابا عامل ب (NF-κB)7،8،9.
تحديد البروتينات المتفاعلة رواية منطقياً-1 مهم لفهم أفضل لنقص إشارات الطريق. على عكس ارنت، وغير مبال بمستويات الأوكسجين وأعرب مؤثرا، محكم ينظم مستويات الأوكسجين الخلوية مستويات البروتين منطقياً-1α. في نورموكسيا (الأكسجين 21%)، البروتينات منطقياً-1α هي سرعة المتدهورة10،11. ويقدم نصف عمر قصيرة منطقياً–1α في نورموكسيا التحديات التقنية المحددة للكشف عن البروتين من مقتطفات الخلية، وكذلك للتعرف على البروتينات منطقياً-1α-التفاعل. وعلاوة على ذلك، ترانسلوكاتي عدة عوامل النسخ بما في ذلك مجمع منطقياً-1 إلى النواة تحت ظروف التاكسج12،،من1314. يتم تنفيذ معظم الأساليب الحالية المستخدمة للدراسات PPI استخدام overexpression غير الفسيولوجية للبروتينات. قد أبلغت هذه overexpression البروتين يسبب تشوهات الخلوية المختلفة من خلال آليات متعددة بما في ذلك الحمل الزائد للموارد واختلال المقايسة والتفاعلات منحل ومسار التعديل15،16. فيما يتعلق بالدراسات PPI، overexpression البروتين يمكن أن يؤدي إلى سلبية إيجابية، أو حتى كاذبة كاذبة، النتائج اعتماداً على خصائص البروتين ووظائف البروتينات أوفيريكسبريسيد. ولذلك، الأساليب الحالية للدراسات PPI تحتاج إلى تعديل كي تكشف القياسية ذات الصلة فسيولوجيا تحت ظروف التاكسج. قد أثبتنا سابقا بالتفاعل بين منطقياً-1 وعامل النسخ الأسرة Ets GA-ملزمة البروتين (جابب) في التاكسج P19 الخلايا، مما يسهم في رد المروج Hes1 على نقص17. هنا، يمكننا وصف بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن co للدراسة القياسية بين البروتينات النووية الذاتية تحت ظروف التاكسج. ويرد كدليل على مفهوم التفاعل بين 1α سكانية وارنت. هذا البروتوكول مناسبة لإثبات أوجه التفاعل بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك تحت ظروف التاكسج، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على تحديد البروتينات المتفاعلة منطقياً-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
مجمع منطقياً-1 هو منظم رئيسي للتوازن الأكسجين الخلوية وينظم عدد كبير جينات المشتركة في الاستجابات التكيفية الخلوية المختلفة لنقص. تحديد البروتينات المتفاعلة منطقياً-1 رواية مهم لفهم توصيل الإشارة التاكسج. تجارب Co-إيمونوبريسيبيتيشن تستخدم عادة للدراسات القياسية لتحديد مسارات توصيل الإش?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أستاذ مشارك الخطيئة أونغ تيونغ لاستخدام محطة العمل نقص. أيد هذا العمل ما يلي: سنغافورة وزارة التعليم، وزارة التربية والتعليم 1T1-02/04 و MOE2015-T2-2-087 (إلى Y.A.)، لي كونغ عجزا كلية الطب، جامعة نانيانغ التكنولوجية بدء المنحة M4230003 (إلى p.o.b.)، “مجلس البحوث السويدية”، مؤسسة بيرسون إرلينغ الأسرة، مؤسسة نوفو نورديسك، Stichting af مؤسسة جوتشنيك والرابطة السويدية لمرض السكري، وشركة التأمين وكالة، وأبحاث السكري ومؤسسة العافية، ومؤسسة مرسى فون كانتزوو، برنامج البحوث الاستراتيجية في مرض السكري في معهد كارولينسكا، المنسق منسق الإغاثة الطارئة-2013-مساعد المدير العام 338936-بيتالماجي، ومؤسسة والنبرغ أليس كنوت.
Materials
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D’Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Génétique. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O’brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes’: The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
