Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Quantitative Analyse des Niveaus der Plasmamembran Verein für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierten Protein durchführen. Die Methode basiert auf die rechnerische Zersetzung der Membran und zytoplasmatischen Komponente des Signals beobachtet in Zellen mit Plasmamembran fluoreszierenden Marker gekennzeichnet.
Abstract
Diese Methode bietet einen schnellen Ansatz für die Ermittlung der Plasmamembran Partitionierung von jedem eindringmittel getaggt peripher-assoziierten Protein mit den Profilen der Fluoreszenzintensität über die Plasmamembran. Gemessenen Fluoreszenz Profile sind durch ein Modell für die Membran und Zytoplasma Fluoreszenz Verteilung entlang einer Linie, die senkrecht auf der Peripherie der Zelle angewendet ausgestattet. Dieses Modell ist aus der Fluoreszenz Intensitätswerte in Referenzzellen auszudrücken eindringmittel getaggt Marker für Zytoplasma und mit FM 4-64-mit der Bezeichnung Plasmamembran gebaut. Die Methode kann auf verschiedene Arten von Zellen und Organismen angewendet werden; Allerdings können nur die Plasmamembranen von nicht benachbarten Zellen ausgewertet werden. Diese schnelle Mikroskopie-basierte Methode eignet sich für Experimente, wo dynamische Veränderungen der Plasmamembran-assoziierten Marker erwartet werden und müssen quantifiziert werden, z.B.bei der Analyse der mutierten Versionen von Proteinen, Inhibitor Behandlungen, und signal-Transduktion Beobachtungen. Die Methode ist eine Multi-Plattform-R-Paket implementiert, die mit einem Makro ImageJ gekoppelt ist, die als eine benutzerfreundliche Oberfläche dient.
Introduction
Peripher-assoziierten Plasmamembran Proteine sind die wichtigsten Komponenten der Zelle Signalwege. Eines ihrer grundlegenden Aufgaben ist ihre transiente Plasmamembran Assoziation und Dissoziation, die wichtig für die Signalübertragung zwischen Plasmamembran und Zytoplasma ist. Plasmamembran peripher-assoziierte Proteine auf Plasmamembran durch Lipid-Anker (N-myristylierung, S-Acylation oder Prenylation) oder durch Lipid-Bindung-Domänen (Interaktion mit Phosphatidylinositol Phosphate, phosphatidic Säure, anbaubar usw.).
Plasmamembran bindenden Eigenschaften dieser Proteine können sein untersucht in Vivo, z. B.wenn ein eindringmittel getaggt Protein durch eine Site-verwiesene Mutagenese der wichtigen Aminosäuren geändert wird, oder wenn es mit verschiedenen Inhibitoren beeinflussen behandelt wird Lipid signaling. Die Verteilungen der peripheren Membranproteine, Plasma werden meist qualitativ, besonders in Fällen geprüft wenn re PROTEINVERTEILUNG offensichtlich ist. Die vorgestellte Methode ist optimal für Situationen, wenn Protein Umverteilung nur teilweise ist und quantitative Bewertung notwendig ist. Ein häufig verwendeter Ansatz Wenn Plasmamembran Vereinigung von konfokalen geschätzt wird laser scanning Mikroskopie-Bildern, wie ein Verhältnis von Fluoreszenz-Intensität an der Plasmamembran und in das Zytoplasma1,2, ist aber nicht einfach, präzise. Fluoreszenz-Intensität in der Plasmamembran reflektieren eine Überlagerung der Plasmamembran und Zytoplasma Signal aufgrund der Lichtbeugung Merkmal für die besondere Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik und optischen Elementen verwendet3. Infolgedessen ist der zytoplasmatischen Signal auch in der Membran-Region enthalten. Aus diesem Grund kann nicht FM 4-64 Färbung Muster für eine Membran Signal Auswahl4als Maske verwendet werden. Darüber hinaus einfache Messungen von Membran-Signal an der Position von FM 4-64 Färbung immer systematisch maximale definiert das echte Plasmamembran Signal des peripher-assoziierten Plasmamembran Protein durch die Überlagerung der überschätzen die Membran und zytoplasmatischen Compound. Das Maximum der beobachteten Signale für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierte Proteine auch nicht zusammen mit dem Maximum der Plasmamembran Marker (d.h. FM 4-64 Styryl Farbstoff) lokalisiert, aber ist das Zytoplasma verlagert. Eine weitere Einschränkung ist, dass der FM 4-64 Emission Höhepunkt im Vergleich zu den Emission Gipfeln für grüne fluoreszierende Proteine wie GFP aufgrund der Wellenlänge-Abhängigkeit von Lichtbeugung3breiter ist.
In die hier beschriebene Methode ist das tagged Protein-Signal durch zwei empirische Funktionen beschreiben einer hypothetischen Verteilung der Plasmamembran und Zytoplasma Signal bzw. ausgestattet. Dieses Signal Zersetzung ist auf lineare Fluoreszenz Profile angewendet, die an der Zelloberfläche senkrecht zur Plasmamembran in Quellbilder, gelten die regulären, Zweikanal-konfokale Abschnitte fluoreszent-markierte Protein zum Ausdruck zu bringen sind Zellen mit FM 4-64 Farbstoff gekennzeichnet.
Die erste Funktion, die für die Montage verwendet beschreibt eine Beugung eines Zytoplasma-Signals auf dem Zellenrand. Es wird von zuvor erworbenen Fluoreszenz Profile erhalten, die in den Zellen, die mit dem Ausdruck eines Zytoplasma Protein Markers markiert durch die gleichen Chromophor als Plasmamembran peripher-assoziierten Protein des Interesses gemessen wurden. Die zweite Funktion beschreibt eine Beugung der Plasmamembran Signal ist die Fluoreszenz von FM 4-64 abgeleitet. Dieses Signal wird zunächst von einer Gaußschen Funktion angenähert, der für eine ungefähre Modellierung von Lichtbeugung eine Punktquelle verwendet wird. Zweitens ist dieses Modell, gültig für rote FM 4-64 Emission mathematisch in der Form umgewandelt, die relevant für einer Emissionswellenlänge von den Chromophor verwendet für die Kennzeichnung von peripher-assoziierte Proteine auf der Plasmamembran von Interesse sind. Beide Funktionen werden durch die maximale Intensität und der Mittelwert von 10 % der höchsten Werte für FM 4-64 und zytoplasmatischen Proteinen Signal bzw. normalisiert. Durch dieses Signal Zersetzung (nicht-lineare mindestens quadratisch Anpassungsmethode) können das Verhältnis der Plasmamembran und Zytoplasma Bruchteil des untersuchten Proteins leicht und genau geschätzt werden. Die realen physische Dimension des berechneten Partitionierungs-Koeffizienten ist im Bereich von Mikrometer, weil zytoplasmatischen Volumenkonzentration mit oberflächenkonzentration auf der Plasmamembran verglichen wird. Es definiert den Abstand zwischen der Plasmamembran Cytoplasma, innerhalb derer die gleiche Menge an Proteinen im angrenzenden Bereich der Plasmamembran lokalisiert ist. Dieser Wert entspricht der Partitionierung Koeffizient K2 eingeführt, zuvor5. Die Methode ist sehr schnell, erfordert nur einzelne konfokale Abschnitte aufgenommen mit Routine konfokale Laser-scanning-Mikroskop, und es ist rechnerisch nicht anspruchsvoll. Der Kern der Analyse in einen tragbaren R-Paket implementiert wurde und eine zusätzliche ImageJ-Makro wurde geschrieben, um grafische Benutzeroberfläche zum Starten der Analysis über die intuitive Dialoge. Software und ausführliche Beschreibung der Methode (früher veröffentlichten6) finden Sie unter http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
Die Methode eignet sich für isolierte Zellen, Protoplasten und Geweben, wo die Plasmamembran der einzelnen Zellen deutlich unterscheidbar ist, mit dem Ausdruck ein eindringmittel getaggt Konstrukt der peripher-assoziierten Protein untersucht. Ein Chromophor kompatibel mit FM 4-64 Färbung verwendet werden muss. FM 4-64 gibt rote Fluoreszenz; Daher kann untersuchten Proteins durch ein Fluoreszenz-Protein mit blauen, grünen oder gelben Emission (z. B.GFP, GFP, YFP) markiert werden. Stabile Transformation von biologischem Material wird empfohlen, weil dadurch weniger künstliche und mehr reproduzierbare Beobachtungen der PROTEINVERTEILUNG. Es ist notwendig, dass die untersuchten Proteine eine relativ homogene zytoplasmatischen Verteilung hat. Die Lokalisation eines Proteins in das endoplasmatische Retikulum oder ein weiteres Fach der intrazellulären Membran kann künstliche Ergebnissen führen.
Darüber hinaus muss das gleiche biologische Material mit dem Ausdruck eines zytoplasmatischen Markers für den Vergleich verwendet werden. Zellen können durch eine kostenlose Chomophore (das gleiche wie für periphere Protein tagging, z. B.kostenlose GLP) oder tagged Proteins des Interesses mit abgeschafft Membran-Bindungskapazität umgewandelt werden. Membran-Bindungskapazität kann, z. B. durch Trimmen der Membran-bindende Domäne oder Site-verwiesene Mutagenese der wichtigen Aminosäure Essigreiniger (z.B. Websites für N-myristylierung, S-Acylation, oder Prenylation, etc.) abgeschafft werden.
Für die konfokale scanning-Mikroskopie müssen Zellen durch eine Membran-Marker wie FM 4-64 Farbstoff gekennzeichnet sein. Wenn FM 4-64 Färbung nicht für das untersuchte Material (wegen störenden Autofluoreszenz, schlechte Farbstoff eindringen, etc.) geeignet ist, können die Plasmamembran, z. B. durch integrale Plasmamembran Protein markiert, eine entsprechende Chomophore (beschriftet werden mCherry, RFP, etc.). Es ist wichtig, dass die Markierung vernachlässigbar Lokalisierung in die intrazellulären Membran Fächer (Endomembranes) hat.
Arbeiten mit festen Proben und Antikörper kann fixierbar analogen FM 4-64FX oder Plasmamembran Kennzeichnung durch Antikörper gegen ein geeignetes Ziel verwendet werden. In diesem Fall ist es wichtig, die Ergebnisse sehr sorgfältig ausgewertet werden, da Fixierung Verfahren zum selektiven Verlust von Proteinen aus dem Zytoplasma und der Plasmamembran führen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode erzeugt eine genauere Schätzung der Plasmamembran Partitionierung für peripher verbunden Proteine, die im Vergleich zu anderen Ansätzen basiert auf der Messung der Fluoreszenz-Intensität-5. Die wesentliche Verbesserung dieser Methode ist, dass die Lichtbeugung und Überlagerung von der Plasmamembran und zytoplasmatischen Signale berücksichtigt. Obwohl diese Methodenergebnisse im Zusammenhang mit Ergebnissen einer einfachen Methode, basierend auf dem Vergleich der…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde unterstützt von NPU ich LO1417 (Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik).
Materials
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | Plasma membrane dye |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 Sigma | Dye solvent |
| Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) | Equipment for cell labelling and microscopy | ||
| Confocal laser scanning microscope | |||
| Ordinary computer |
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