Een snelle beeld-gebaseerde bacteriële virulentie Assay met behulp van Amoeba
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het meten van de virulentie van de planktonische of oppervlak-ingeschrevenen bacteriën met behulp van D. discoideum (amoeba) als een host. Virulentie wordt gemeten over een periode van 1 h en host doden is gekwantificeerd aan de hand van de fluorescentie microscopie en beeld-analyse. We laten zien dat dit protocol met behulp van de bacterie P. aeruginosa.
Abstract
Traditionele bacteriële virulentie tests omvatten langdurige blootstelling van bacteriën in de loop van enkele uren naar gastheer cellen. Gedurende deze tijd, kunnen bacteriën ondergaan veranderingen in de Fysiologie als gevolg van de blootstelling aan groei hostomgeving en de aanwezigheid van de cellen van de gastheer. We ontwikkelden een test voor het snel meten van de staat van de virulentie van de bacteriën die de mate waarop bacteriën in aanwezigheid van cellen van de gastheer groeien te minimaliseren. Bacteriën en amoeben zijn vermengd en geïmmobiliseerd op een enkel imaging vliegtuig met behulp van een agar-pad. De procedure wordt eencellige fluorescentie imaging met calceïne-acetoxymethyl ester (calceïne-AM) als een indicator van host cell gezondheid. De fluorescentie van cellen van de gastheer wordt geanalyseerd na 1 h van de blootstelling van cellen van de gastheer aan bacteriën met behulp van microscopie van epifluorescence. De software van de analyse van de afbeelding wordt gebruikt voor het berekenen van een host doden index. Deze methode is gebruikt voor het meten van de virulentie binnen planktonische en oppervlakte-ingeschrevenen Pseudomonas aeruginosa subpopulatie tijdens het beginstadium van biofilm vorming en kunnen worden aangepast aan andere bacteriën en andere stadia van biofilm groei. Dit protocol biedt een snelle en robuuste methode voor het meten van de virulentie en veel van de complexiteit die is gekoppeld aan de groei en het onderhoud van zoogdieren cellijnen vermijdt. Virulentie fenotypen hier gemeten met behulp van amoeben zijn ook gevalideerd met behulp van de muis macrofagen. Deze test werd met name gebruikt om die oppervlakte bijlage upregulates virulentie in P. aeruginosa.
Introduction
Bacteriële infectie is een van de hoofdoorzaken van mortaliteit in mens en dier1,2. De mogelijkheid voor het meten van de virulentie van bacteriën in culturen of biofilms is belangrijk in instellingen voor gezondheidszorg en onderzoek. Hier beschrijven we een veelzijdige, snelle en relatief eenvoudige methode om te kwantificeren van bacteriële virulentie. De eukaryotische organisme Dictyostelium discoideum (amoeba) wordt gebruikt als de modelorganisme voor de host. D. discoideum is gebruikt als een host virulentiefactoren in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 en andere bacteriën6,7 te identificeren ,8 en is gevoelig voor grotendeels dezelfde Virulentiefactoren die de cellen van de zoogdieren doden, met inbegrip van type III secretie9,10. Vorige virulentie testen met behulp van D. discoideum betrokken zijn langdurige blootstelling van bacteriën met D. discoideum cellen in de loop van uren3,4,5. Het protocol, hier, presenteert een snelle methode voor het bepalen van de virulentie met behulp van deze amoeba. Dit protocol (Figuur 1) beschrijft hoe: (1) groeien de amoeben axenically (in de afwezigheid van bacteriën), (2) groeien bacteriën voor de assay, (3) bereiden bacteriën en cellen van de gastheer voor microscopie, (4) het uitvoeren van epifluorescence microscopie, en (5) analyseren amoeba fluorescentie.
Amoeben zijn aanvankelijk streaked uit uit bevroren voorraden en gegroeid op een gazon van Escherichia coli (E. coli), waar de amoeben produceren sporen. Deze sporen zijn geplukt en geënt in een verrijkte medium voor een groei. De amoeben worden onderhouden via een groei in voedselrijke omstandigheden totdat ze klaar om te worden gemengd met bacteriën voor de beoordeling van bacteriële virulentie. De overleving of de dood van de amoeben wordt gekwantificeerd door het meten van de fluorescentie van calceïne-acetoxymethyl (calceïne-AM), die door intracellulaire esterasen gekloofd en, daardoor, geactiveerd voor fluorescentie11,12. Live amoeben vertonen weinig of geen fluorescentie overwegende dat benadrukt en stervende cellen fluoresceren intens. Dit resultaat is te wijten aan een weinig of geen opneming van calceïne-AM in gezonde amoeben en integratie en splijten van het substraat in gespannen amoeben13. Dit gedrag verschilt met name van calceïne-AM fluorescentie in zoogdiercellen11,14,15,16.
Bacteriën die zullen worden beoordeeld op virulentie worden afzonderlijk gekweekt. Hier beschrijven we hoe te meten van de virulentie van de opportunistische pathogenen P. aeruginosa en hoe te kwantificeren van de virulentie van de planktonische (zwemmen) en oppervlakte-ingeschrevenen subpopulatie in detail te beschrijven. Dit protocol kan worden aangepast aan het testen van de virulentie van andere bacteriën. In de sectie vertegenwoordiger resultaten tonen we dat virulentie is geactiveerd in oppervlak vastgehechte cellen en laag in planktonische cellen is, die werd gemeld eerder13. Virulentie-geactiveerde oppervlak-ingeschrevenen P. aeruginosa doodt amoeben, terwijl niet-virulente planktonische cellen worden verbruikt door de amoeben. Als de virulentie van de planktonische bacteriën is uitsluitend wordt bepaald, kunnen de bacteriën gekweekt in gewone cultuur buizen in plaats van met behulp van petrischalen, zoals beschreven in het protocol.
De groei van amoeben en P. aeruginosa culturen moet worden gecoördineerd zodat P. aeruginosa culturen de beoogde groeifase bereiken, terwijl de amoeben in stabiele toestand in voedselrijke omstandigheden groeit. Deze voorwaarde vereist normaliter amoeben culturen moeten worden verdund ten minste 1 dag voorafgaand aan wanneer ze worden gemengd met bacteriën. Amoeben en bacteriën zijn geïmmobiliseerd met agar pads zijn mede bebroede gedurende 1 uur, en beeld met behulp van een lage resolutie (10 X, numerieke diafragma 0.3) objectieve, groene fluorescentie proteïne (GFP) filters en een imaging camera. Analyse kan worden uitgevoerd met behulp van vrij toegankelijke ImageJ software of software van de analyse van de afbeelding aangepast. Onze analyse werd uitgevoerd met behulp van onze eigen software geschreven met behulp van een wetenschappelijke analyse pakket13. De software moet een masker met behulp van de fase contrast-afbeelding maken en fluorescentie waarden extraheren op basis van de gemaskerde gebieden in de afbeelding van de fluorescentie. Fluorescentie waarden zijn gemiddeld ten minste 100 cellen, wat resulteert in een numerieke host doden index.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol wordt een snelle en kwantitatieve methode assay virulentie in P. aeruginosabeschreven. Dit protocol kan worden getest met andere bacteriën. Het is echter belangrijk om te houden in het achterhoofd dat het groeimedium verenigbaar met de voorwaarden van de groei amoeba zijn moet. In het bijzonder, hebben wij het protocol gebruikt PS:DB als de bacteriële groeimedium geoptimaliseerd. Als andere media worden gebruikt, is het mogelijk dat het noodzakelijk is voor het uitvoeren van een groei-dit is een a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KP AS schreef en herziene versie van het manuscript. KP de experimenten en de analyse uitgevoerd. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (NIH) Career Transition Award (K22AI112816) te AS.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O’Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
