एक तेजी से छवि आधारित बैक्टीरियल डाह परख अमीबा का उपयोग
Summary
यहां, हम एक मेजबान के रूप में डी discoideum (अमीबा) का उपयोग कर planktonic या सतह से जुड़े बैक्टीरिया के डाह को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । डाह 1 एच की अवधि में मापा जाता है और मेजबान की हत्या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण का उपयोग कर quantified है । हम इस जीवाणु पी aeruginosaका उपयोग कर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन ।
Abstract
पारंपरिक बैक्टीरियल डाह परख कई घंटे के पाठ्यक्रम पर बैक्टीरिया की लंबे समय तक जोखिम मेजबान कोशिकाओं को शामिल । इस समय के दौरान, बैक्टीरिया विकास पर्यावरण और मेजबान कोशिकाओं की उपस्थिति की मेजबानी के लिए जोखिम के कारण शरीर क्रिया विज्ञान में परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैं । हम एक परख के लिए तेजी से बैक्टीरिया की डाह राज्य उपाय है कि किस हद तक बैक्टीरिया मेजबान कोशिकाओं की उपस्थिति में वृद्धि को कम करने के लिए विकसित की है । बैक्टीरिया और amoebae एक साथ मिश्रित कर रहे हैं और एक एकल इमेजिंग विमान पर एक आगर पैड का उपयोग कर मैटीरियल. प्रक्रिया एकल-कक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग calcein-acetoxymethyl एस्टर (calcein-AM) के साथ होस्ट सेल स्वास्थ्य के एक संकेतक के रूप में उपयोग करता है । मेजबान कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर बैक्टीरिया को मेजबान कोशिकाओं के प्रदर्शन के 1 ज के बाद विश्लेषण किया जाता है । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए एक मेजबान हत्या सूचकांक गणना किया जाता है । इस पद्धति में planktonic और सतह से जुड़ी Pseudomonas aeruginosa उप-आबादी के भीतर डाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है और फिल्म के गठन के प्रारंभिक चरण के दौरान अंय बैक्टीरिया और अंय फिल्म विकास के चरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल डाह को मापने की एक तेजी से और मजबूत विधि प्रदान करता है और स्तनधारी सेल लाइनों के विकास और रखरखाव के साथ जुड़े कई जटिलताओं से बचा जाता है । डाह phenotypes मापा यहां का उपयोग amoebae भी किया गया है मांय माउस मैक्रोफेज का उपयोग कर । विशेष रूप से, इस परख के लिए उपयोग किया गया था कि सतह लगाव aeruginosaमें डाह को विनियमित स्थापित ।
Introduction
बैक्टीरियल संक्रमण मानव और पशुओं में मृत्यु के प्रमुख कारणों में से एक है1,2. संस्कृतियों या फिल्मों में बैक्टीरिया के डाह को मापने की क्षमता स्वास्थ्य और अनुसंधान सेटिंग्स में महत्वपूर्ण है । यहां, हम एक बहुमुखी, तेजी से वर्णन है, और अपेक्षाकृत सरल बैक्टीरियल डाह यों तो विधि । eukaryotic जीव Dictyostelium discoideum (अमीबा) मॉडल मेजबान जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है । D. discoideum एक मेजबान के रूप में इस्तेमाल किया गया है Pseudomonas aeruginosa में डाह कारकों की पहचान (पी. aeruginosa)3,4,5 और अंय बैक्टीरिया6,7 ,8 और काफी हद तक एक ही डाह कारक है कि प्रकार III स्राव9,10सहित स्तनधारी कोशिकाओं को मारने के लिए अतिसंवेदनशील है । पिछले डाह discoideum का उपयोग कर परख घंटे3,4,5के पाठ्यक्रम पर डी. discoideum कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया के लंबे समय तक जोखिम शामिल है । प्रोटोकॉल, यहां, इस अमीबा का उपयोग कर डाह निर्धारित करने का एक तेजी से विधि प्रस्तुत करता है । इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का वर्णन कैसे करने के लिए: (1) amoebae axenically (बैक्टीरिया के अभाव में) बढ़ने, (2) परख के लिए बैक्टीरिया बढ़ने, (3) बैक्टीरिया और माइक्रोस्कोप के लिए मेजबान कोशिकाओं को तैयार, (4) epifluorescence माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन, और (5) का विश्लेषण अमीबा प्रतिदीप्ति.
Amoebae शुरू में जमे हुए शेयरों से बाहर निकल रहे है और ई कोलाई (ई. कोलाई), जहां Amoebae बीजाणु का उत्पादन के एक लॉन पर हो गया । इन बीजाणुओं को axenic वृद्धि के लिए समृद्ध माध्यम में चुना और inoculated जाता है । amoebae पोषक तत्वों से भरपूर परिस्थितियों में axenic वृद्धि के माध्यम से बनाए रखा जाता है जब तक वे बैक्टीरियल डाह के आकलन के लिए बैक्टीरिया के साथ मिश्रित होने के लिए तैयार हैं । अस्तित्व या amoebae की मृत्यु calcein-acetoxymethyl (calcein-AM) के प्रतिदीप्ति को मापने से quantified है, जो intracellular esterases से सट जाता है और, जिससे प्रतिदीप्ति11,12के लिए सक्रिय हो जाता है । लाइव amoebae प्रदर्शन कम या कोई प्रतिदीप्ति जबकि जोर दिया और मर कोशिकाओं fluoresce तीव्रता से । यह परिणाम calcein के एक छोटे या कोई निगमन के कारण है-स्वस्थ amoebae और शामिल करने और तनाव में सब्सट्रेट के दरार में हूं13amoebae । यह व्यवहार विशेष रूप से अलग है calcein-AM प्रतिदीप्ति स्तनधारी कक्षों में11,14,15,16।
बैक्टीरिया है कि डाह के लिए मूल्यांकन किया जाएगा अलग से उगाया जाता है । यहां, हम बताते है कि कैसे अवसरवादी रोगज़नक़ पी aeruginosa और विस्तार के डाह को मापने के लिए कैसे planktonic (तैराकी) और सतह से जुड़ी उप आबादी डाह की मात्रा बढ़ाता है । इस प्रोटोकॉल के लिए अंय बैक्टीरिया की डाह परीक्षण अनुकूलित किया जा सकता है । प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम बताते है कि डाह सतह संलग्न कोशिकाओं में सक्रिय है और planktonic कोशिकाओं में कम है, जो पहले13बताया गया था । डाह-आपन सतह से जुड़ी पी. aeruginosa मारती amoebae जबकि गैर विषमय planktonic कोशिकाओं का सेवन amoebae द्वारा किया जाता है. यदि planktonic बैक्टीरिया की डाह पूरी तरह से परख की जा रही है, बैक्टीरिया साधारण संस्कृति ट्यूबों में बजाय पेट्री व्यंजन का उपयोग कर के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित किया जा सकता है ।
amoebae और aeruginosa संस्कृतियों की वृद्धि का समंवय किया जाना चाहिए ऐसी है कि पी aeruginosa संस्कृतियों का इरादा विकास के दौर तक पहुंचने जबकि amoebae पोषक तत्वों से भरपूर परिस्थितियों में स्थिर राज्य में बढ़ रहे हैं । इस हालत में आम तौर पर amoebae संस्कृतियों की आवश्यकता है जब वे जीवाणुओं के साथ मिश्रित कर रहे हैं करने से पहले से कम 1 दिन पतला हो । Amoebae और बैक्टीरिया के मैटीरियल पैड का उपयोग कर रहे हैं, सह रहे है 1 के लिए मशीन, और एक कम संकल्प (10x, संख्यात्मक एपर्चर ०.३) उद्देश्य, हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) फिल्टर, और एक इमेजिंग कैमरा का उपयोग कर imaged । विश्लेषण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ImageJ सॉफ्टवेयर या अनुकूलित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है । हमारे विश्लेषण एक वैज्ञानिक विश्लेषण13पैकेज का उपयोग कर लिखा हमारे अपने सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था । सॉफ्टवेयर एक मुखौटा चरण कंट्रास्ट छवि का उपयोग कर बनाने और प्रतिदीप्ति छवि में नकाबपोश क्षेत्रों से प्रतिदीप्ति मूल्यों को निकालने चाहिए । प्रतिदीप्ति मूल्यों पर औसत से कम १०० कोशिकाओं, एक संख्यात्मक मेजबान हत्या सूचकांक में जिसके परिणामस्वरूप हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल aeruginosaमें डाह परख करने के लिए एक तेजी से और मात्रात्मक विधि का वर्णन । इस प्रोटोकॉल अंय बैक्टीरिया के साथ परीक्षण किया जा सकता है । तथापि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि विकास के माध्य?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
केपी और के रूप में लिखा और पांडुलिपि संशोधित । केपी ने प्रयोगों और विश्लेषण का प्रदर्शन किया. इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) कैरियर संक्रमण पुरस्कार (K22AI112816) के रूप में करने के लिए द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
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