Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para medir a virulência das bactérias planctônicas ou conectado à superfície usando d. discoideum (ameba) como um host. Virulência é medida durante um período de 1h e anfitrião matando é quantificada usando análise de imagem e de microscopia de fluorescência. Vamos demonstrar a este protocolo utilizando a bactéria p. aeruginosa.
Abstract
Ensaios de virulência bacteriana tradicionais envolvem exposição prolongada de bactérias ao longo de várias horas para células hospedeiras. Durante este tempo, as bactérias podem sofrer alterações na fisiologia devido a exposição ao ambiente de crescimento de host e a presença de células hospedeiras. Desenvolvemos um ensaio para avaliar rapidamente o estado de virulência de bactérias que podem minimizar a extensão a que as bactérias crescem na presença de células hospedeiras. As bactérias e as amebas são misturadas e imobilizadas em um avião de imagem usando um bloco de ágar. O procedimento usa imagens de fluorescência de célula única com calceína-acetoximetil éster (calceína-AM) como um indicador da saúde de célula do hospedeiro. A fluorescência das células do hospedeiro é analisada após 1 h de exposição das células do hospedeiro para bactérias usando microscopia de epifluorescência. Software de análise de imagem é usado para calcular um índice de mortes do anfitrião. Este método tem sido usado para medir a virulência dentro planctônicos e conectado à superfície Pseudomonas aeruginosa sub-populações durante o estágio inicial de formação de biofilme e pode ser adaptado para outras bactérias e outras fases de crescimento do biofilme. Este protocolo fornece um método rápido e robusto de virulência de medição e evita muitas das complexidades associadas ao crescimento e manutenção de linhas de células de mamíferos. Fenótipos de virulência medidos aqui usando amebas também foram validados usando macrófagos de rato. Em particular, este ensaio foi usado para estabelecer essa virulência de upregulates acessório superfície em p. aeruginosa.
Introduction
Infecção bacteriana é uma das principais causas de mortalidade em humanos e animais,1,2. A capacidade de medir a virulência de bactérias em culturas ou biofilmes é importante em contextos de cuidados de saúde e pesquisa. Aqui, descrevemos um método relativamente simples, rápido e versátil para quantificar a virulência bacteriana. O organismo eucariótico Dictyostelium discoideum (ameba) é usado como o organismo hospedeiro do modelo. D. discoideum tem sido usado como um host para identificar fatores de virulência em Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 e outras bactérias6,7 ,8 e é suscetível a em grande parte os mesmos fatores de virulência que matam células de mamíferos incluindo tipo III secreção9,10. Ensaios de virulência anterior usando d. discoideum envolveram exposição prolongada de bactérias com células de d. discoideum ao longo de horas3,4,5. O protocolo, aqui, apresenta um método rápido de determinar a virulência usando essa ameba. Este protocolo (Figura 1) descreve como: (1) crescem as amebas axenically (na ausência de bactérias), (2) crescer bactérias para o ensaio, (3) preparar as bactérias e células hospedeiras para microscopia, (4) realizar microscopia de epifluorescência e (5) analisar ameba fluorescência.
Amebas são inicialmente listradas fora dos estoques congelados e crescidas em um gramado de Escherichia coli (e. coli), onde as amebas produzem esporos. Estes esporos são escolheu e inoculados em um meio enriquecido para o crescimento axénica. As amebas são mantidas através de crescimento axénica em condições ricas em nutrientes até que estejam prontos para serem misturados com as bactérias para a avaliação de virulência bacteriana. A sobrevivência ou a morte das amebas é quantificada pela medição da fluorescência de calceína-acetoximetil (calceína-AM), que é clivada por esterases intracelulares e, desse modo, ativado por fluorescência11,12. Ao vivo amebas apresentam pouca ou nenhuma fluorescência Considerando que salientou e células morrendo brilham intensamente. Este resultado é devido a uma pequena ou nenhuma incorporação de calceína-AM em amibas saudáveis e incorporação e clivagem do substrato em amibas estressado13. Esse comportamento é notavelmente diferente da fluorescência de calceína-AM em células de mamíferos11,14,15,16.
Bactérias que serão avaliadas para virulência são cultivadas separadamente. Aqui, descrevemos como medir a virulência do patógeno oportunista p. aeruginosa e detalhe como quantificar a virulência de planctônica (natação) e as subpopulações conectado à superfície. Este protocolo pode ser adaptado para testar a virulência de outras bactérias. Na seção de resultados de representante, mostramos que virulência é ativada nas células conectado à superfície e baixa em células planctônicas, que foi relatado anteriormente13. Virulência-ativado conectado à superfície de p. aeruginosa mata amebas enquanto não-virulenta células planctônicas são consumidas pelas amebas. Se a virulência das bactérias planctônicas unicamente está sendo analisada, as bactérias podem ser cultivadas em tubos de cultura comum, ao invés de usar placas de Petri, conforme descrito no protocolo.
O crescimento das amebas e p. aeruginosa culturas deve ser coordenado, tal que p. aeruginosa culturas alcançar a fase de crescimento pretendido enquanto as amebas estão crescendo no estado estacionário em condições ricas em nutrientes. Esta condição geralmente requer culturas amebas para ser diluído pelo menos 1 dia antes de quando eles são misturados com bactérias. Amebas e bactérias são imobilizadas usando almofadas de ágar, são incubadas co por 1h e fotografaram usando uma resolução baixa (10 X, abertura numérica 0.3) filtra proteínas fluorescência objetiva, verde (GFP) e uma câmera de imagens. Análise pode ser realizada usando disponível gratuitamente software ImageJ ou personalizado software de análise de imagem. Nossa análise foi realizada usando nosso próprio software escrito usando um pacote de análise científica13. O software deve criar uma máscara usando a imagem de contraste de fase e extrair valores de fluorescência das áreas mascaradas na imagem de fluorescência. Valores de fluorescência são calculados pelo menos 100 células, resultando em um índice de mortes de anfitrião numérica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método rápido e quantitativo para ensaio de virulência em p. aeruginosa. Este protocolo pode ser testado com outras bactérias. No entanto, é importante ter em mente que o meio de crescimento deve ser compatível com as condições de crescimento de ameba. Em particular, otimizamos o protocolo usando PS:DB como meio de crescimento bacteriano. Se forem utilizados outros meios de comunicação, pode ser necessário realizar um controle de somente mídia de crescimento em que não há…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KP e como escreveu e revisou o manuscrito. KP realizados os experimentos e a análise. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de transição de carreira do National Institutes of Health (NIH) (K22AI112816) às.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
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