Быстрое на основе образа бактериальных вирулентности Assay, используя амебы
Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки вирулентности планктонные или придает поверхности бактерий, используя D. discoideum (амебы) в качестве хоста. Вирулентность измеряется в течение 1 ч и принимающих убийство количественно с помощью флуоресцентной микроскопии и изображения анализа. Мы демонстрируем это протокол, с помощью бактерий P. aeruginosa.
Abstract
Традиционные вирулентности бактерий анализы включают длительное воздействие бактерий в течение нескольких часов, чтобы клетки хозяина. В это время бактерии могут претерпеть изменения в физиологии вследствие воздействия среды размещения роста и наличие клеток хозяина. Мы разработали assay быстро оценить состояние вирулентности бактерий, которые сводят к минимуму степень которой бактерий расти в присутствии клетки хозяина. Бактерии и амебы смешиваются и иммобилизованные на одной плоскости изображения с помощью площадку агар. В процедуре используется одноклеточных флуоресценции изображений с Флуорексон acetoxymethyl эфира (Флуорексон ам) в качестве показателя здоровья принимающей ячейки. Флуоресценции клеток хозяина анализируется после 1 h воздействия клеток хозяина бактерии с помощью эпифлуоресцентного. Программное обеспечение для анализа изображений используется для вычисления индекса убийство хоста. Этот метод был использован для измерения вирулентность в течение планктонных и придает поверхности синегнойной палочки подгрупп населения на начальном этапе биопленки и могут быть адаптированы для других бактерий и других стадий роста биопленки. Этот протокол обеспечивает быстрый и надежный метод измерения вирулентности и позволяет избежать многих сложностей, связанных с ростом и обслуживание линий клеток млекопитающих. Вирулентности фенотипов измеряется здесь, с помощью амёбы также были проверены с помощью мыши макрофагов. В частности создать что вирулентности upregulates поверхности насадку в P. aeruginosaбыл использован этот assay.
Introduction
Бактериальная инфекция является одной из ведущих причин смертности в человека и животных1,2. Возможность измерения вирулентности бактерий в культурах или биоплёнки имеет важное значение в настройки здравоохранение и исследований. Здесь мы описываем универсальный, быстрое и относительно простой метод количественной оценки вирулентности бактерий. Эукариотические организм сапротрофные discoideum (амебы) используется в качестве модели организм хозяина. D. discoideum используется в качестве узла для определения факторов вирулентности синегнойной палочки (P. aeruginosa)3,,45 и другие бактерии6,7 ,8 и подвержены значительной же факторы вирулентности, которые убивают mammalian клеток, включая тип III секрецию9,10. Предыдущих анализов вирулентности, используя D. discoideum участвовали длительного воздействия бактерий с D. discoideum клетки в течение часа3,4,5. Протокол, здесь, представляет быстрый метод определения вирулентности, используя этот амебы. Этот протокол (рис. 1) описывает как: (1) растут амёбы axenically (в отсутствие бактерий), (2) растут бактерий для assay, (3) подготовить бактерий и клеток хозяина для микроскопии, (4) выполняют эпифлуоресцентного и (5) анализировать амебы флуоресцирование.
Амёб первоначально прожилками из замороженных запасов и выращенных на лужайке Escherichia coli (E. coli), где амёбы производят споры. Эти споры взял и прививку в обогащенных среду для стерильных роста. Амебы поддерживаются через стерильных роста в условиях питательн-богатые люди, пока они не готовы быть смешанной с бактерий для оценки вирулентности бактерий. Выживание или смерть амёбы количественно измеряя флуоресценции Флуорексон acetoxymethyl (Флуорексон AM), который расщепляется на внутриклеточную эстераз и, таким образом, активированный для флуоресценции11,12. Живой амёбы проявляют мало или вообще не флуоресценции в то время, как подчеркнул и умирающие клетки флуоресцировать интенсивно. Этот результат обусловлен немного или не включение Флуорексон-ам в здоровых амеб и включения и расщепления субстрата в подчеркнул амёбы13. Это поведение особенно отличается от Флуорексон ам флуоресценции в mammalian клетках11,14,,1516.
Бактерии, которые будут оцениваться для вирулентности выращивается отдельно. Здесь мы опишем, как измерить вирулентности оппортунистических патогенов P. aeruginosa и подробно, как количественной оценки вирулентности планктонных (плавание) и придает поверхности подгрупп населения. Этот протокол может быть адаптирована для проверки вирулентности других бактерий. В разделе представитель результаты, мы показывают, что вирулентности активируется в придает поверхности клетки и низка в планктонных клеток, который было сообщено ранее,13. Придает поверхности активированного вирулентности P. aeruginosa убивает амёбы пока не вирулентные планктонных клетки потребляются амёбы. Если является исключительно быть assayed вирулентности бактерий, планктонные, бактерии могут быть культивировали в обычных культуры трубы, а не с помощью Петри, как описано в протоколе.
Рост амеб и P. aeruginosa культур должна координироваться таким образом, что P. aeruginosa культур достичь этапа предполагаемого роста, в то время как амёбы растут в устойчивом состоянии в условиях питательн-богатые люди. Это условие обычно требует амёбы культур быть разведен по крайней мере за 1 день до, когда они смешиваются с бактериями. Амебы и бактерий карданной передачи были заблокированы с помощью агар колодки, совместно инкубирован за 1 ч и образы, используя низкое разрешение (10 X, числовая апертура 0,3), объективной, зеленый флуоресценции белков (ГПУП) фильтры и тепловизионной камеры. Анализ может быть выполнена с использованием свободно доступных ImageJ программного обеспечения или настроить программное обеспечение для анализа изображения. Наш анализ проводился с использованием собственного программного обеспечения, написанные с использованием научного анализа пакета13. Программное обеспечение должно создать маску с использованием фазы контраст изображения и извлекать значения флуоресценции из замаскированные области в изображении флуоресценции. Флуоресценции значения усредняются над по крайней мере 100 клетки, в результате в индексе убийство численные хоста.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает быстрое и количественный метод для анализа вирулентности в P. aeruginosa. Этот протокол может испытываться с другими бактериями. Однако важно иметь в виду, что средство роста должны быть совместимы с условиями роста амебы. В частности мы оптимизировали протокол, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
КП и как писал и пересмотренный рукописи. КП провели эксперименты и анализа. Эта работа была поддержана премии Переход карьеры национальных институтов здравоохранения (НИЗ) (K22AI112816) на AS.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O’Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
