في فيفو نانوفيكتور إيصال اسفنجة ميكرورنا الخاصة بالقلب
Summary
تثبيط microRNA الأنسجة على حدة هي تكنولوجيا التي متخلفة في ميدان ميكرورنا. هنا، نحن وصف بروتوكول لتمنع الأسرة microRNA مير-181 في خلايا ميوبلاست بنجاح من القلب. تستخدم تكنولوجيا نانوفيكتور لتسليم ميكرورنا الأسفنج الذي يوضح هامة في فيفو الخاصة بأمراض القلب مير-181 الأسرة تثبيط.
Abstract
ميكرورنا (ميرنا) الصغيرة غير الترميز الجيش الملكي النيبالي الذي يحول دون التعبير بوستترانسكريبشونال رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً). الأمراض التي تصيب الإنسان، مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية، أظهرت لتنشيط الأنسجة و/أو التعبير ميرنا الخلية المحددة المرتبطة بتطور المرض. تثبيط التعبير ميرنا يوفر إمكانيات تدخل علاجي. بيد أن النهج التقليدي تمنع ميرناس، توظيف النوكليوتيد أنتاجومير، تؤثر على مهام محددة ميرنا عند التسليم العالمية. وهنا، نقدم بروتوكول لتثبيط القلب على حدة في فيفو الأسرة مير-181 في نموذج الفئران. بناء ميرنا-الأسفنج يهدف إلى تشمل 10 ربط مكافحة مير-181 المتكررة متواليات. هو استنساخ المروج الخاصة بأمراض القلب α-MHC إلى العمود الفقري بيجفب محرك التعبير الخاصة بأمراض القلب مير-181 ميرنا-الأسفنج. لإنشاء خلية مستقرة transfected مع بناء α-MHC-EGFP-miR-181-sponge خط معربا عن مير-181-الأسفنج، ميوبلاست H9c2 الخلايا ومفروزة حسب الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) في التجارة والنقل الإيجابي H9c2 الخلايا التي تستزرع مع النيوميسين (G418). في أعقاب النمو المستقر في النيوميسين، تحدد السكان خلية [مونوكلونل] إضافية نظام مراقبة الأصول الميدانية واستنساخ خلية مفردة. الخلايا H9c2-مير-181-الأسفنج-التجارة والنقل ميوبلاست الناتجة عن معرض فقدان وظيفة مير-181 أفراد الأسرة كما قيمت من خلال التعبير زيادة البروتينات المستهدفة مير-181 ومقارنة مع الخلايا H9c2 الإعراب عن الأسفنج تدافع غير وظيفية. وبالإضافة إلى ذلك، علينا تطوير نانوفيكتور لتقديم منهجية بناء مير-181-الأسفنج قبل إلى إيجابيا يحمل جسيمات نانوية الاسمافرون واتهم سلبا والبلازميدات مير-181-الأسفنج. في فيفو تصوير للتجارة والنقل يكشف عن أن حقن الوريد ذيل متعددة من نانوفيكتور على مدى فترة ثلاثة أسابيع قادرة على تعزيز تعبير عن مير-181-الأسفنج بشكل كبير بطريقة خاصة بأمراض القلب. الأهم من ذلك، لوحظ فقدان وظيفة مير-181 في أنسجة القلب ولكن ليس في الكلي أو الكبد. ميرنا-الأسفنج وسيلة قوية تمنع التعبير ميرنا الأنسجة على حدة. يقود التعبير ميرنا-الأسفنج من مروج الأنسجة على حدة ويوفر خصوصية لتثبيط ميرنا، الذي يمكن أن يقتصر على جهاز أو الأنسجة المستهدفة. وعلاوة على ذلك، الجمع بين التكنولوجيات نانوفيكتور والإسفنج ميرنا تصاريح الإنجاز الفعال وميرنا الأنسجة على حدة تثبيط في فيفو.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين، كانت هناك العديد من الدراسات التي أشارت إلى أهمية دور ميرناس في الأمراض التي تصيب البشر. وتبين النتائج من مجموعة كبيرة من المؤلفات لا ينكر أهمية ميرناس في الفسيولوجيا المرضية للأمراض، مثل1 من السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية2،3،،من45. على سبيل المثال، مير-21 أوبريجولاتيد في العديد من أنواع السرطان، أدى زيادة دورة الخلية والخلية انتشار6. عدوى التهاب الكبد الوبائي، مير-122 دوراً هاما في النسخ المتماثل من فيروس7، وقد ثبت أن تثبيط مير-122 إنقاص الحمولة الفيروسية8. في تضخم القلب، مير-212/132 أوبريجولاتيد في القلب وهو يشارك في النمط الظاهري المرضية9. الأهمية الواضحة downregulation أو تثبيط الوظيفية ميرنا upregulated يشير إلى الفرص لاستغلال علاجية بيولوجيا ميرنا في تقريبا جميع الأمراض.
تم العثور على أربعة أفراد الأسرة مير-181، مير-181a/ب/ج/د، في ثلاثة مواقع الجينوم في الجينوم البشري. ترميز المنطقة إينترونيك الجينات المضيفة الحمض النووي الريبي غير الترميز (MIR181A1-HG) الكتلة مير-181–ب-1. ترميز المنطقة إينترونيك من الجينات NR6A1 مير-181-/ب-2. الكتلة مير-181-c/d يقع في نسخة أونتشاراكتيريزيد على كروموسوم 19. مشاركة جميع أفراد الأسرة مير-181 نفس تسلسل “البذور” ويمكن أن يحتمل أن تنظم جميع أفراد الأسرة الأربعة مير-181 نفس الأهداف مرناً.
نحن3،4 وغيرها10 أبرزت أهمية مير-181 أفراد الأسرة أثناء فشل القلب نهاية مرحلة. وقد اعترفنا أيضا أن upregulation مير-181 ج يحدث تحت الظروف المرضية المرتبطة زيادة خطر الإصابة بأمراض القلب، مثل النوع الثاني من السكري والسمنة والشيخوخة3،،من45. وقد تم افترض أن overexpression من مير-181 ج يسبب الأكسدة مما يؤدي إلى الخلل في القلب4.
العديد من المجموعات قد اقترح أن ميرنا موجودة في الميتوكوندريا11،12،،من1314، إلا أننا كنا الأول من إثبات أن 181 ج-مير مشتق من الجينوم النووي، معالجة، و وفي وقت لاحق ذوبانها إلى الميتوكوندريا في ال RISC3. وعلاوة على ذلك، اكتشفنا تعبير منخفضة مير-181a و 181b مير في حجرة المتقدرية القلب5. الأهم من ذلك، وجدنا أن 181 ج-مير تقمع التعبير مرناً COX1 طن متري، مدللة بذلك على أن ميرناس المشاركة في تنظيم الجينات mitochondrial وتغيير الوظيفة المتقدرية3،4.
تتناول هذه المقالة المنهجية اللازمة لتصميم ميرنا اسفنجة نهدم أسرة مير-181 في cardiomyocytes. وعلاوة على ذلك، فإننا مخطط بروتوكول للتطبيق في فيفو مير-181-الأسفنج.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه المقالة وصف التصميم وتوليف اسفنجة ميرنا وأظهر كيفية التعبير الخاصة بالانسجة من الأسفنج أداة قوية تمنع التعبير الأسرة ميرنا الأنسجة على حدة.
لقد أظهرنا أن يمكن استنساخ عائلة مير-181 استهداف الأسفنج إلى تعبير بلازميد مع مروج القلب على حدة. يمكن تعبئتها بلازميد كفاءة في جس?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر أنتوني ليونغ ل. ك. قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية، كلية بلومبرغ للصحة العامة، جامعة جونز هوبكنز لبلده التقنية المساعدة في تصميم بناء مير-181-الأسفنج. ونشكر أيضا بولينا سيسا-شاه وكاثلين جابريلسون إدارة الجزيئية و “النسبية بل”، مؤسسات جونز هوبكنز الطبية الخاصة بالمساعدة التقنية بالتصوير في فيفو إيصال اسفنجة ميرنا.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، HL39752 (لتشارلز ستينبرجين) ومنحة تنمية عالم من 14SDG18890049 “جمعية القلب الأمريكية” (إلى Das سامارجيت). مروج خاصة بالقلب الفئران قدمت سخاء “جيفري د مولكينتين” في مستشفى سينسيناتي “الأطفال”.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
References
- Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
- Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
- Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
- Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
- Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
- Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
- Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
- Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
- Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
- Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
- Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
- Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
- Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
- Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
- Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
- Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
- Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
- Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
- Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
- Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
- Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
- Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
- Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
- Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2′-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
- Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
- Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
- Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
- Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).
