Préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)-base de métabolomique

Résumé

Ce protocole décrit comment préparer des larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS.

Résumé

Les progrès récents dans le domaine de la métabolomique ont établi la drosophile Drosophila melanogaster comme un puissant modèle génétique pour étudier le métabolisme des animaux. En combinant la vaste gamme d’outils génétiques drosophile avec la possibilité d’arpenter les grandes étendues du métabolisme intermédiaire, une approche métabolomique peut révéler des interactions complexes entre diet, génotype, événements démographiques et des signaux environnementaux. En outre, les études métabolomiques peuvent découvrir de nouveaux mécanismes enzymatiques et découvrir jusque-là inconnues des connexions entre les voies métaboliques apparemment disparates. Afin de faciliter une utilisation plus répandue de cette technologie auprès de la communauté de drosophile , ici, nous fournissons un protocole détaillé qui décrit comment préparer des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)- base d’analyse de la métabolomique. Notre protocole inclut des descriptions de prélèvement d’échantillons de larves, d’extraction de métabolite, dérivatisation chimique et analyse par CPG-SM. La réussite de ce protocole permettra aux utilisateurs de mesurer l’abondance relative des petits métabolites polaires, y compris les acides aminés, sucres et acides organiques impliqués dans la glycolyse et les cycles TCA.

Introduction

La drosophile Drosophila melanogaster est apparu comme un système idéal pour étudier les mécanismes moléculaires qui régulent le métabolisme intermédiaire. Non seulement la plupart des voies métaboliques conservées entre la drosophile et les humains, mais capteurs en éléments nutritifs principaux et régulateurs de croissance, comme l’insuline, Tor et myc, sont également actifs dans la mouche^1,2. En conséquence, drosophile peut servir à explorer la base métabolique de maladies allant du diabète et l’obésité neurodégénérescence et du cancer. À cet égard, le développement larvaire de

Protocole

1. collecte des œufs

1. Recueillir des adultes mâles et femelles vierges des génotypes désirées. L’âge individuellement ces animaux dans un flacon de nourriture avec des supports de Bloomington standard pour 3 à 5 jours.
2. Mettre en place les accouplements appropriés en transférant 50 femelles vierges et 25 hommes un nouveau flacon de nourriture.
   NOTE : Un minimum de six accouplements indépendants devrait être mis en place pour chaque génotype. On recueillera seulement un échantillon de chaque croisement (c.-à-d. six échantillons prélevés sur six des accouplements indépendants).
3. Préparer les casquettes de Ponte de mélasse.....

Résultats

Lactate déshydrogénase (dLDH) des mutants qui n’ont pas d’activité dLDH⁴et témoins du même génétiquement ont été recueillis sous forme de larves de milieu-L2 et traitées selon le protocole décrit ci-dessus. Par rapport aux témoins, mutants larves présentent des changements significatifs en lactate et pyruvate L-2-hydroxyglutarate⁴. Les spectres ont été acquises avec un système d’Agilent GC6890-5973i MS. Un exemple des spectres GC-MS.......

Discussion

Métabolomique fournit une occasion sans pareille d’arpenter les réactions métaboliques qui composent le métabolisme intermédiaire. La sensibilité de cette technologie, toutefois, restitue des données sensibles au bagage génétique, les indices du développement et une variété de contraintes environnementales, y compris la température, l’humidité, la densité de population et la disponibilité des nutriments. Par conséquent, une haute qualité et reproductibles métabolomique analyse exige que les échantillons soient recueillie.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mélasse noire non soufrée	Good Food, INC
Drosophila Agar Type II	Genesee Scientific	66-103
Pyridine	EMD Millipore	PX2012-7
Méthoxyamine hydrocholoride (MOX)	MP Biomedicals, LLC	155405
MSTFA avec 1 % de triméthylchlorosilane	Sigma	69478
Fleischmann' s Levure sèche active	AB Mauri Food Inc	2192
Bouteille de 6 oz pour drosophile	Genesee Scientific	32-130
Mélange d’homogénéisation des tissus mous (tubes de 2 mL)  ;	Omni International	SKU :19-627
Insert de flacon, 250 & micro ; L verre désactivé avec pieds en polymère	Agilent	5181-8872
Acide succinique-2,2,3,3-d4	Sigma	293075
SpeedVac	Thermo  ;	SC210A
o-Acide phosphorique	Fisher Scientific	A242-1
Acide propionique	Sigma	P5561
p-Hydroxy benzoïque acide méthyle	Genesee Scientific	20-258
Bead Ruptor	Omni International	SKU :19-040E
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000012
Agitateur MultiTherm avec un bloc de 24 X 12 mm	Benchmark Scientific	H5000
Méthanol	Sigma	34860
Tube à centrifuger de 1,5 mL	Eppendorf	22364111
Falcon 35 X 10 mm Boîte de culture tissulaire	Corning Incorporated	353001
colonne GC	Phenomex	ZB-5MSi