सीटू में संकरण के लिए तकनीक आयल-एंबेडेड वयस्क कोरल नमूने
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि तेल में एंबेड किया गया है और कांच स्लाइड पर खोदी वयस्क मूंगा नमूनों पर सीटू संकरण में प्रदर्शन करने के लिए है । यह एक गुणात्मक-आयल-एंबेडेड ऊतकों में एक आरएनए विरोधी भावना जांच की स्थानिक अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है ।
Abstract
कोरल महत्वपूर्ण महासागर अकशेरूकीय है कि समग्र महासागर स्वास्थ्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मानव स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण हैं । हालांकि, इस तरह के महासागर तापमान और महासागर अंलीकरण बढ़ती के रूप में मानव प्रभावों के कारण, कोरल तेजी से खतरे में हैं । इन चुनौतियों से निपटने के लिए, सेल में अग्रिम और आणविक जीवविज्ञान कोरल के स्वास्थ्य के निदान के लिए महत्वपूर्ण साबित हो गया है । आमतौर पर मानव चिकित्सा में इस्तेमाल किया तकनीकों में से कुछ को संशोधित बहुत शोधकर्ताओं के इलाज और कोरल को बचाने की क्षमता में सुधार कर सकता है । इस पते के लिए, सीटू संकरण में मानव चिकित्सा और विकासवादी विकास जीव विज्ञान में मुख्य रूप से इस्तेमाल के लिए एक प्रोटोकॉल तनाव के तहत वयस्क कोरल में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है ।
इस विधि का उद्देश्य है कि तेल में एंबेड किया गया है और कांच स्लाइड पर खोदी वयस्क मूंगा ऊतक में एक आरएनए जांच की स्थानिक अभिव्यक्ति कल्पना है । इस विधि नमूना के तेल और निर्जलीकरण के हटाने पर केंद्रित है, नमूने की पारगम्यता सुनिश्चित करने के लिए उपचार, पूर्व संकरण की मशीन, आरएनए जांच के संकरण, और आरएनए की जांच के दृश्य है । यह एक शक्तिशाली तरीका है जब गैर मॉडल जीवों का उपयोग करने की खोज जहां विशिष्ट जीन व्यक्त कर रहे हैं, और प्रोटोकॉल आसानी से अंय गैर मॉडल जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि, विधि में सीमित है कि यह मुख्य रूप से गुणात्मक है, क्योंकि अभिव्यक्ति तीव्रता दृश्यावलोकन चरण और जांच की एकाग्रता के दौरान उपयोग किए गए समय की मात्रा के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । इसके अलावा, धैर्य की आवश्यकता है, के रूप में इस प्रोटोकॉल को 5 दिनों तक ले जा सकते है (और कई मामलों में, अब) जांच के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा है । अंत में, गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला आम है, लेकिन इस सीमा को दूर किया जा सकता है ।
Introduction
कोरल महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी तंत्र बिल्डरों और महासागर और मानव स्वास्थ्य1,2,3में जैव विविधता के लिए महत्वपूर्ण हैं । वे जलवायु परिवर्तन और अंय anthropogenic तनाव के कारण खतरे में हैं, और कई कोरल प्रजातियों गंभीर खतरे में माना जाता है । इस प्रकार, तनाव के तहत कोरल का निदान करने के लिए सेलुलर और आणविक उपकरणों के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है । इसके अलावा, वहां थोड़ा के बारे में समझ में जहां जीन वयस्क कोरल ऊतक के भीतर व्यक्त कर रहे हैं, और इसलिए इन जीनों के कार्यों की थोड़ी समझ है । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम में अनुकूलित है सीटू संकरण (ISH) प्रोटोकॉल, आमतौर पर मानव चिकित्सा और विकासवादी विकासात्मक जीवविज्ञान में इस्तेमाल किया, वयस्क मूंगों के तेल-एम्बेडेड ऊतक के नमूनों पर उपयोग के लिए. यह तकनीक सबसे शक्तिशाली है जब वयस्क मूंगों कि गर्मी तनाव के लिए जोखिम के रूप में एक तनावपूर्ण घटना आया है पर इस्तेमाल किया । हालांकि, इस तकनीक के ऊतकों और कोरल में जीवन चरणों की एक विस्तृत श्रृंखला पर इस्तेमाल किया जा सकता है और केवल गर्मी बल दिया मूंगों4,6,7तक ही सीमित नहीं है । इसके अतिरिक्त, इस तकनीक के ऊतकों या किसी भी metazoan कोशिकाओं के रूप में जब तक वहां सीडीएनए अनुक्रम जानकारी उपलब्ध है पर इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इस विधि के प्रयोजन के लिए वयस्क कोरल ऊतक है कि संरक्षित और तेल में एंबेडेड और स्लाइड पर खोदी गई है के भीतर आरएनए जांच कल्पना है । इस विधि एक शक्तिशाली नैदानिक उपकरण है कि वयस्क कोरल ऊतक के भीतर न्यूक्लिक एसिड के दृश्य के लिए अनुमति देता है । शुरू में इस विधि चिकित्सा निदान के लिए विकसित किया गया था, और इसके बाद से इस तरह के विकास जीवविज्ञान और विकासवादी विकास जीवविज्ञान8,9,10के रूप में खेतों में एक लोकप्रिय उपकरण बन गया है । ISH भी एक महत्वपूर्ण तरीका है, विशेष रूप से गैर में मॉडल सिस्टम, जब जीनोमिक और transcriptomic अनुक्रम डेटा उपलब्ध हैं, लेकिन स्थानिक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न अज्ञात हैं । गैर में नैदानिक काम के लिए मॉडल सिस्टम, इस तकनीक शक्तिशाली है क्योंकि यह संकेत कर सकते है जो कोशिकाओं और ऊतकों ब्याज की जीन व्यक्त और अधिक लक्षित चिकित्सकीय दृष्टिकोण8,9,10के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, 11,12. अंत में, इस तकनीक गुणात्मक और अधिक शक्तिशाली है जब मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति डेटा11के साथ युग्मित ।
इस पत्र में उल्लिखित दृष्टिकोण उन शोधकर्ताओं के हित का होगा जिन्होंने पहले से ही एक digoxigenin (डीआईजी)-लेबल आरएनए जांच (दोनों नब्ज और antisense जांच) तैयार कर ली है और अब जांच के एक नमूने को लेकर सीटू संकरण में प्रदर्शन करने के लिए तैयार है । इस विधि को करने के लिए, एक तेल मूंगा ऊतक के दो धारावाहिक वर्गों प्रत्येक जांच के लिए आवश्यक हो जाएगा परीक्षण किया जा रहा है । एक सेक्शन का इस्तेमाल नब्ज जांच के लिए और दूसरे को antisense जांच के लिए किया जाएगा । भाव जांच पर नियंत्रण रहेगा न कि गैर विशिष्ट बंधन का संकेत । अगर धुंधला भाव जांच में मनाया जाता है, तो antisense जांच हित की आरएनए के लिए विशिष्ट नहीं है । जांच के किसी भी जीन व्यक्त के लिए डिजाइन किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, कई उदाहरण पहले कोरल में गर्मी तनाव के दौरान व्यक्त किया जा पाया गया है कि इस्तेमाल किया जाता है: FBJ murine ऑस्टियो वायरल oncogene homolog बी (फोस-बी), उत्प्रेरक प्रोटीन (AP1), और ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर ४१ (TNFR ४१)11. ISH खुदाई का उपयोग-लेबल आरएनए जांच के रेडियोधर्मी जांच का उपयोग कर अधिक पसंद है क्योंकि उनके हैंडलिंग ज्यादा10सुरक्षित है । इसके अलावा, इस तकनीक अत्यधिक संवेदनशील है और गर्मी से परे ऊतकों और भ्रूण की एक विस्तृत श्रृंखला पर किया जा सकता है, वयस्क मूंगों13,14,15,16।
Protocol
Representative Results
Discussion
विधि इस प्रोटोकॉल में वर्णित चिकित्सा और विकासवादी विकासात्मक अनुसंधान में पिछले काम से संशोधित किया गया है8,9,10,12,17। इस प्रोटोकॉल एक खुदाई ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के द्वारा वित्त पोषित किया गया पुरस्कार सं. ॉचे-१३२३६५२ के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन महासागर विज्ञान Postdoctoral फैलोशिप और पुरस्कार सं 1012629 बरोज वेलकम फंड Postdoctoral संवर्धन कार्यक्रम से ।
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
