In Situ Hybridisierung Techniken für Paraffin-eingebetteten Erwachsenen Korallen Proben
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist in Situ Hybridisierung auf Erwachsenen Korallen Proben durchführen, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurden. Dies ist eine qualitative Methode zur Visualisierung des räumlichen Ausdrucks einer RNA Gegenstrang Sonde in Paraffin-eingebetteten Gewebe verwendet.
Abstract
Korallen sind wichtige Ozean Wirbellosen, die entscheidend für die allgemeine Gesundheit der Meere sowie die menschliche Gesundheit sind. Korallen sind jedoch durch menschliche Einflüsse wie steigenden Meerestemperaturen und Versauerung bedroht. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, erwiesen Fortschritte in der Zell- und Molekularbiologie sich für die Gesundheit der Korallen Diagnose von entscheidender Bedeutung. Ändern einige der häufig in der Humanmedizin verwendet Techniken könnte erheblich verbessern Forscher Fähigkeit Korallen zu behandeln. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein Protokoll zur in Situ Hybridisierung verwendet, vor allem in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie angepasst für den Einsatz in Erwachsenen Korallen unter Stress.
Der Zweck dieser Methode ist den räumliche Ausdruck einer RNA-Sonde in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurde. Diese Methode konzentriert sich auf die Entfernung des Paraffins und Rehydrierung der Probe, Vorbehandlung der Probe zur Durchlässigkeit der Probe, Pre-Hybridisierung Inkubation, Hybridisierung der RNA-Sonde und Visualisierung der RNA-Sonde zu gewährleisten. Dies ist eine leistungsfähige Methode, wenn nicht Modellorganismen mit um zu entdecken, wo bestimmte Gene exprimiert, und das Protokoll kann für andere Modellorganismen leicht angepasst werden. Die Methode ist jedoch beschränkt, dass es sich in erster Linie qualitative, da Ausdruck Intensität, abhängig von der Höhe der Zeit während der Visualisierung Schritt und die Konzentration der Sonde verwendet variieren kann. Darüber hinaus ist Geduld erforderlich, da dieses Protokoll bis zu 5 Tagen (und in vielen Fällen länger) abhängig von der verwendeten Sonde nehmen kann. Zu guter Letzt unspezifische Hintergrundfärbung ist üblich, aber diese Einschränkung überwunden werden kann.
Introduction
Korallen sind kritische Ökosystem Bauherren und wichtig für die biologische Vielfalt in den Ozean und menschliche Gesundheit1,2,3. Sie sind bedroht durch Klimawandel und anderen anthropogenen Stressfaktoren, und viele Korallenarten gelten als vom Aussterben bedroht. Somit ist ein erheblicher Bedarf für Zelluläre und molekulare Werkzeuge zur diagnose von Korallen unter Stress. Außerdem ist es wenig über wo Gene innerhalb von Erwachsenen korallengewebes und daher wenig Verständnis für die Funktionen dieser Gene exprimiert werden verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir in Situ Hybridisierung (ISH), häufig verwendete Protokoll in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie, für den Einsatz auf Paraffin-eingebetteten Gewebeproben von Erwachsenen Korallen angepasst. Diese Technik ist mächtigsten auf Erwachsenen Korallen verwendet, die ein belastendes Ereignis wie Hitzestress unterzogen wurden. Doch diese Technik kann auf eine Vielzahl von Geweben und Lebensphasen in Korallen verwendet werden und beschränkt sich nicht nur Wärme betonte Korallen4,6,7. Darüber hinaus kann diese Technik auf Gewebe oder Zellen von jeder riffbildende verwendet werden, solange gibt es cDNA-Sequenzinformationen.
Der Zweck dieser Methode ist, RNA-Sonden in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die bewahrt und in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Diagnosetool, das für die Visualisierung von Nukleinsäuren in Erwachsenen korallengewebe ermöglicht. Ursprünglich wurde diese Methode für die medizinische Diagnostik entwickelt, und es ist seitdem ein beliebtes Hilfsmittel in Bereichen wie Entwicklungsbiologie und evolutionären Entwicklungsbiologie8,9,10. ISH ist auch eine kritische Methode, vor allem in nicht-Modellsysteme, wenn genomische und transkriptomischen Sequenzdaten sind verfügbar, aber räumliche gen Expressionsmuster sind unbekannt. Für die diagnostische Arbeit in nicht-Modellsystemen ist diese Technik mächtig, weil sie angeben kann, welche Zellen und Geweben ein Gen des Interesses Express und zu mehr zielgerichtete Therapieansätze8,9,10führen, 11,12. Zu guter Letzt ist diese Technik qualitativer und leistungsfähiger, wenn gepaart mit quantitativen Gen Ausdruck Daten11.
In diesem Papier skizzierte Ansatz werden von Interesse für Forscher, die bereits eine Digoxigenin (DIG) entworfen haben-mit der Bezeichnung RNA-Sonde (Sinn und Antisense-Sonden) und sind nun bereit, in Situ Hybridisierung der Sonden zu einer Probe durchführen. Um diese Methode durchzuführen, benötigt zwei Schnittserien eines Gewebes, Paraffin Korallen für jede Sonde getestet. Ein Teil wird für die Sinne-Sonde und die andere für die antisense-Sonde verwendet werden. Die Sinn-Sonde wird ein Steuerelement an unspezifischen Bindung sein. Wenn Färbung in der Sinn-Sonde beobachtet wird, ist die antisense-Sonde nicht spezifisch für die RNA von Interesse. Sonden können für jedes Gen ausgedrückt ausgelegt werden. In diesem Protokoll werden mehrere Beispiele verwendet, die bisher gefunden wurden, während Hitzestress in Korallen ausgedrückt werden: FBJ murinen Osteosarkom viral Oncogene Homolog B (Fos-B), Activator Protein (AP1) und Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor 41 (TNFR 41)11. ISH mit DIG-Label RNA-Sonden wird vorgezogen mit radioaktiven Sonden, weil deren Handhabung viel sicherer10ist. Darüber hinaus ist diese Technik ist sehr empfindlich und kann auf eine Vielzahl von Geweben und Embryonen über Wärme-gestressten Erwachsenen Korallen13,14,15,16durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde von der früheren Arbeit in medizinischen und evolutionäre Entwicklungsforschung8,9,10,12,17geändert. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nuancen der eine in Situ Hybridisierung mit einer Grabung beschriftet RNA Gegenstrang Sonde auf Erwachsenen Korallen, die konserviert und in Paraffin eingebett…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Award finanziert keine. OCE-1323652 durch die National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship und Award-no.1012629 von Burroughs Wellcome Fonds Postdoctoral Enrichment Program.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
