In Situ Hybridisering tekniker för Paraffin-inbäddat vuxen korall prover
Summary
Målet med detta protokoll är att utföra i situ hybridisering på vuxen korall prover som har bäddats in i paraffin och sektioneras på objektglas. Detta är en kvalitativ metod som används för att visualisera det rumsliga uttrycket för en RNA anti känsla probe i paraffin-inbäddat vävnader.
Abstract
Koraller är viktigt ocean ryggradslösa djur som är kritiska för ocean hälsa samt människors hälsa. Dock på grund av mänsklig påverkan såsom stigande hav temperaturer och havsförsurning är koraller alltmer hotade. För att tackla dessa utmaningar, har framstegen inom cell- och molekylärbiologi visat sig vara avgörande för att diagnostisera hälsa av koraller. Ändra några av de tekniker som ofta används inom humanmedicinen kunde förbättra forskarnas förmåga att behandla och spara koraller. För att åtgärda detta, har ett protokoll för i situ hybridisering används främst inom humanmedicinen och evolutionär utvecklingsbiologi anpassats för användning i vuxen koraller under stress.
Syftet med denna metod är att visualisera det rumsliga uttrycket för en RNA-probe i vuxen korall vävnad som har bäddats in i paraffin och sektioneras på objektglas. Denna metod fokuserar på avlägsnande av paraffin och rehydrering av provet, förbehandling av provet att säkerställa permeabilitet av prov, före hybridisering inkubation, hybridisering av RNA sonden och visualisering av RNA sonden. Detta är en kraftfull metod när du använder icke-modellorganismer för att upptäcka där specifika gener uttrycks, och protokollet kan enkelt anpassas för andra icke-modellorganismer. Metoden är dock begränsad eftersom det är främst kvalitativ, eftersom uttrycket intensitet kan variera beroende på mängden tid som används under steget visualisering och koncentrationen av sonden. Dessutom krävs tålamod, eftersom detta protokoll kan ta upp till 5 dagar (och i många fall längre) beroende på sonden används. Slutligen, icke-specifik bakgrundsfärgning är vanligt, men denna begränsning kan övervinnas.
Introduction
Koraller är kritiska ekosystem byggare och viktig för den biologiska mångfalden i havet och människors hälsa1,2,3. De är hotade på grund av klimatförändringar och andra antropogena stressfaktorer och många korallarter betraktas som akut hotad. Det finns således ett betydande behov av cellulära och molekylära verktyg för att diagnostisera koraller under stress. Också, det är lite förstås om där generna uttrycks inom vuxen korall vävnad och därför lite förståelse för funktionerna av dessa gener. Om du vill åtgärda det här problemet har vi anpassat i situ hybridisering (ISH) protokollet, vanligen används i humanmedicin och evolutionär utvecklingsbiologi, för användning på paraffin-inbäddat vävnadsprover på vuxen koraller. Denna teknik är mest kraftfulla när de används på vuxna koraller som har genomgått en stressande händelse såsom exponering för värmestress. Men denna teknik kan användas på ett brett utbud av vävnader och levnadsstadier i koraller och är inte begränsad till endast värme-stressade koraller4,6,7. Dessutom kan denna teknik användas på vävnader eller celler av någon metazoan så länge det finns cDNA sekvensinformation.
Syftet med denna metod är att visualisera RNA sonder i vuxen korall vävnad som har bevarat och inbäddade i paraffin och sektioneras på bilder. Denna metod är ett kraftfullt diagnostiska verktyg som möjliggör visualisering av nukleinsyror inom vuxen korall vävnad. Utvecklades inledningsvis denna metod för medicinsk diagnostik, och det har sedan dess blivit ett populärt verktyg inom utvecklingsbiologi och evolutionär utvecklingsbiologi8,9,10. ISH är också en kritisk metod, särskilt i icke-modellsystem, när genomisk och transcriptomic sekvens uppgifter finns tillgängliga men rumsliga gen uttrycksmönster är okänd. För diagnostiska arbetet i icke-modellsystem är denna teknik kraftfulla eftersom det kan indikera vilka celler och vävnader express en gen av intresse och kan leda till mer riktade behandlingsmetoder8,9,10, 11,12. Slutligen, denna teknik är kvalitativa och mer kraftfull när den är ihopparad med kvantitativ gen uttryck data11.
Det synsätt som beskrivs i detta dokument kommer att vara av intresse för forskare som redan har utformat en digoxigenin (DIG)-märkt RNA sonden (både känsla och antisense sonder) och är nu redo att utföra i situ hybridisering av sonderna till ett urval. För att utföra denna metod, kommer två seriella sektioner av en paraffin korall vävnad att behövas för varje sond som testas. En del kommer att användas för sonden avkänningen och den andra för antisense sonden. Sonden avkänningen blir en kontroll för att ange icke-specifik bindning. Om missfärgning observeras i sonden avkänningen, då är antisense sonden inte specifika för RNA av intresse. Sonderna kan utformas för någon gen uttryckt. I detta protokoll, flera exempel används som befanns tidigare uttryckas under värmestress i koraller: FBJ murina osteosarkom virala onkogen homolog B (Fos-B), Activator protein (AP1), och tumörnekrosfaktor receptor 41 (TNFR 41)11. ISH använder gräva-märkt RNA sonder är att föredra framför med radioaktiva sonder eftersom deras hantering är mycket säkrare10. Dessutom, denna teknik är mycket känsliga och kan utföras på ett brett utbud av vävnader och embryon utöver värme-stressad vuxen koraller13,14,15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs i detta protokoll har ändrats från tidigare arbete i medicinsk och evolutionära utvecklings forskning8,9,10,12,17. Detta protokoll fokuserar på nyanserna i ett i situ -hybridisering med en gräva-märkt RNA anti känsla sond på vuxen koraller, som har bevarat och inbäddade i paraffin. Denna metod kan lätt överföras till…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av award ingen. OCE-1323652 genom den nationella Science Foundation Ocean vetenskap postdoktorsstipendium och award no.1012629 från Burroughs Wellcome fonden postdoktorala berikande Program.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
