세균성 세포는 높은 공간 구성 됩니다. 느린 성장 Myxococcus xanthus 셀에이 조직은 시간이 지남에 따라, 여러 세대에 걸쳐 spatiotemporal 고해상도 형광 라이브 셀 이미징에 대 한 설정 개발 되었다. 이 메서드를 사용 하 여 염색체 분리 및 세포 분열에 대 한 중요 한 단백질의 spatiotemporal 역학 결정 수 있습니다.
세균성 세포의 형광 라이브 셀 이미징 단백질과 중앙 세포 주기 이벤트 기본 염색체의 공간과 일시적인 역동성의 분석에서 주요 방법입니다. 그러나, 이미지 느린 성장 박테리아 나타냅니다에 이러한 분자의 fluorophores 및 phototoxicity의 photobleaching 때문에 도전 이미지 수집 중입니다. 여기, 우리가 Myxococcus xanthus (이 4-6 h의 세대 시간)의 경우이 한계를 우회 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 위해, M. xanthus 셀 두꺼운 영양소를 포함 한 천 패드 온도 제어 습 한 환경에서 재배 됩니다. 이러한 조건 하에서 우리가 단일 세포의 성장에 따라 개별 셀의 두 배로 시간을 결정 합니다. 또한, 주요 휴대와 같은 염색체 분리 및 세포 분열 여러 이상 ParB-YFP, FtsZ-GFP, mCherry PomX 등 관련 붙일 레이블된 마커 단백질을 포함 하는 셀의 형광 라이브 셀 이미징으로 이미지로 수 처리 셀 순환입니다. 그 후, 인수 이미지 montages 또는 영화를 생성 하기 위해 처리 됩니다.
세균성 세포는 공간적으로 매우 많은 단백질 세포질 구획1,2,,34이내 비대칭으로 지역화 구성 됩니다. 이 지역화 종종 매우 동적 이며, 세포 주기 신호 또는 외부 신호에 대 한 응답에서 시간에 따라 변화. 동등 하 게, 세균성 염색체는 공간적으로 매우 개별 loci 전과 분리 과정5중 특정 subcellular 위치에 배치 되 고 조직. 이 동적 공간 조직, 사업부, 세포 주기 규칙, 차별화, 운동 성, 신호 변환으로 염색체 조직 성장과 분리;에 대 한 중요 하다 따라서, 그것은 세균성 기능의 기본적으로 모든 측면을 영향을 줍니다.
이 세포질 과정의 spatiotemporal 역학 대장균, 새 균의 subtilis, 비 브리 오 cholerae, 및 Caulobacter crescentus 중요 한 봉사와 다른 세균성 종의 다양 한 분석 되 모형 유기 체입니다. 그러나,이 4 개의 종만 거 대 한 세균성 다양성의 작은 스펙트럼을 커버 되며, 아마도 당연히 이러한 종 사이의 큰 계통 발생 거리를 감안할 때, 세포 조직 및 양극 화 메커니즘에 다른 박테리아입니다. 이 결국 세균 세포의 spatiotemporal 역학 기본 일반적인 원리를 추출 수 추가 세균성 종을 공부에 대 한 필요를 발생 시킵니다.
그람 음성 델타 proteobacterium M. xanthus 박테리아6협력과 사회적 행동의 연구에 모델 생물 이다. M. xanthus 엄격한 되 고 그것은 세포 바깥쪽 높은 조정에, 집단 패션과 다른 미생물7먹이 확산 식민지를 형성 하는 영양소, 존재. 영양소 부족에 대응, 셀, 내부 셀의 수천의 구성 된 fruiting 시체의 형성에서 발달 프로그램 시작 막대 모양의 운동 세포 분화에 구형 2 중 포자8. 행동, 즉, 군비 및 fruiting 몸 형성의 두 종류만 고체 표면에 있는 세포에 의해 실행 됩니다. 또한, 두 영양 조건 셀에에서 참여 직접 셀 연락처 운동 성 자극 하거나 받는 사람9,10 독 기능 외부 막 단백질의 교환 등을 포함 하는 프로세스 , LPS11, exopolysaccharides에 인접 하 여 운동 성 자극의 교환12, 셀 및 셀에 의해 신호 세포 표면-정박 단백질13,14신호.
최근, M. xanthus 모델 유기 체 공부 운동 성 규정15, 세포 분열16,,1718및 염색체 조직19 기본 메커니즘에 대 한 될 수 있다 ,,2021. 중요 한 단계는 M. xanthus 세포 주기 관련 붙일 레이블된 단백질16, 를 들고 긴장에 스냅 샷 이미지 또는 짧은 시간 경과 녹음을 사용 하 여 형광 현미경으로 자세히 분석 된 17,18,,1920. 이상적으로, 많은 셀 따라야 한다 단일 셀 해상도와 형광 라이브 셀 이미징 세포 주기 매개 변수에 강력한 양적 데이터를 얻기 위해 하나 이상의 전체 세포 주기 위한 여. 그러나, 이것은의 경우에 도전 M. xanthus 표준 실험실 조건에서 4-6 h는 상대적으로 긴 세대 시간이 고 fluorophores 및 이미지 수집 동안 phototoxicity의 photobleaching 때문에.
여기, 우리 따라 프로토콜 설명 M. xanthus 형광 라이브 셀 적어도 24 h에 대 한 이미징 및 여러 세포 주기를 포함 하 여 단일 셀 해상도 셀. 중요 한 것은, 전체 프로토콜 중 셀 천 패드에 유지 됩니다 및 연락처 종속 활동의 소셜 라이프 스타일에 대 한 필수적인 수 문의 가까이에 M. xanthus. 프로토콜 또한 모니터 모양, 크기, 사단, 및 형광 프로브에 대 한 사용자가 단일 셀 해상도 높은 시간 해상도에 있으며 따라서, 셀 다양성의 정량화 및 세포 주기 이벤트의 상관 관계를 수 있습니다.
형광 라이브 셀 이미징 세균성 세포의 spatiotemporal 역학을 공부 하는 강력한 도구 되고있다. 그러나와 같은 운동 및 느린 성장 박테리아의 시간 경과 형광 현미경 M. xanthus,, 도전 되었으며 짧은 시간 기간에 대해서만 수행 했다. 여기, 우리 제시의 라이브 셀 이미징에 대 한 쉬운–사용 하 고 강력한 방법 M. xanthus 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해. 이 메서드를 사용 하면 셀과 단일 셀 해상도 세포 주기의 여러 라운드 붙일 레이블된 단백질에 따라 수 있습니다.
느린 성장의 라이브 셀 이미징의 성공에 영향을 주는 몇 가지 필수 구성 요소는 M. xanthus 세포를 포함 하 여: 1) 셀 첨부;에 대 한 단단한 표면 영양분과 산소; 2) 여부 3) 일정 한 습도 온도; 그리고 4) 노출 시간과 이미지 수집 주파수 등 실험 조건의 최적화.
우리의 실험 설정, 영양소 보충 두꺼운 agarose 패드 사용 합니다. 단일 셀을 따라 미세 장치 반대 agarose 두꺼운 패드를 사용 하 여 몇 가지 기본적인 혜택만도 몇 가지 단점이 있다. 첫째, agarose 패드 뿐만 아니라에 대 한 화면을 제공 합니다 M. xanthus 첨부 파일 및 운동 뿐만 아니라 적어도 24 h에 대 한 성장 위한 충분 한 영양소를 세포. 둘째, 스냅 샷된 분석 일반적으로 붙일 레이블된 단백질의 세포내 지역화를 공부 하는 데 사용 이전 agarose 패드16,,1729의 동일한 종류에서 수행 되었다. 따라서, 스냅 샷된 분석에서 데이터는 여기에 설명 된 방법으로 얻은 데이터를 직접 비교할 수 있습니다. 셋째, agarose 패드를 쉽게 수정 하 고 항생제 또는 CuSO4 등 다른 보충 교재와 보충 수 있습니다 그리고 vanillate 일반적으로 위해 사용 되는 유전자 식 유도18,30. 마지막으로, 세포 실험 과정 중 양식 microcolonies 수 있습니다, 때문에이 설정 또한 허용 한다 분석 되 고 특정 매개 변수에서 직접 셀 상호 작용의 효과 공부. 이 점은의 경우 특히 중요 한 M. xanthus 이 박테리아 표시 여러 연락처 종속 상호 작용 때문에. 이 방법의 주요 결점은 실험 조건 실험의 기간에 대 한 사전 설정 됩니다. 대조적으로, 미세 장치는 일반적으로 항생제31예를 들어 추가 하 여 실험 과정 중 실험 조건 변경 허용.
무료 소프트웨어 패키지 (예를 들어, MicrobeJ, Oufti) 자동으로 단일 세포 및 개별 세포 내 단백질 지 방화의 성장을 분석을 사용할 수 있습니다. 그러나,이 소프트웨어는 단일 셀 또는 셀의 작은 그룹의 분석에 적합. 따라서, 그것은 자동으로 여기에 설명 된 24 시간 기록에 대해 생성 된 데이터 분석에 대 한 도전 남아 있습니다.
요약, 우리는 느린 성장 라이브 셀 이미징 수행 하는 쉬운–사용 하 고 재현할 수 프로토콜 설명 M. xanthus 박테리아. 우리는 간단한 영양소 보충 agarose 패드는 적어도 24 시간에 대 한 성장을 유지 하 고 관찰 하 고 분석 단백질 지 방화 및 여러 세대에 걸쳐 단일 셀 해상도와 성장에 대 한 허용 하는 충분 한 보여줍니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품에 의해 독일 연구 위원회 (DFG) Transregio 174 “Spatiotemporal 역학의 세균성 세포의 프레임 워크 내에서 지원 했다” 고 맥스 플랑크 사회.
DMI6000B with AFC | Leica microsystems | 11888945 | Automated inverted widefield fluorescence microscope with adaptive focus control |
Universal mounting frame | Leica microsystems | 11532338 | Stage holder for different sample sizes |
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3 | Leica microsystems | 11506197 | Phase contrast objective |
Orca Flash 4.0 camera | Hamamatsu | 11532952 | 4.0 megapixel sCMOS camera for picture aquisition |
Filter set TXR ET, k | Leica microsystems | 11504170 | Fluorescence filter set, Ex: 560/40 Em: 645/75 |
Filter set L5 ET, k | Leica microsystems | 11504166 | Fluorescence filter set, Ex: 480/40 Em: 527/30 |
Filter set YFP ET, k | Leica microsystems | 11504165 | Fluorescence filter set, Ex: 500/20 Em: 535/30 |
ProScan III | Prior | H117N1, V31XYZEF, PS3J100 | Microscope automation controller with interactive control center |
EL 6000 light source | Leica microsystems | 11504115 | External fluorescence light source |
Incubator BLX Black | Pecon | 11532830 | Black incubation chamber surrounding the microscope |
Tempcontrol 37-2 digital | Leica microsystems | 11521719 | Automated temperature control for incubation chamber |
Gentmycin sulphate | Carl Roth | 0233.4 | Gentamycin |
Oxytetracylin dihydrate | Sigma Aldrich | 201-212-8 | Oxytetracyclin |
Kanamycin sulphate | Carl Roth | T832.3 | Kanamycin |
Filtropur BT25 0.2 bottle top filter | Sarstedt | 831,822,101 | Bottle top filter for sterilization of buffers |
Deckgläser | VWR | 630-1592 | Glass cover slip (60 x 22 mm, thickness: 0.7 mm) |
Seakem LE agarose | Lonza | 50004 | Agarose for microscopy slides |
Leica Metamorph AF | Leica microsystems | 11640901 | Microscope control software and software for picture analysis |
Tetraspeck Microsperes, 0.5 µm | ThermoFisher | T7281 | Fluorescent microspheres |
petri dish | Greiner Bio-one | 688102 | 120 mm x 120 mm x 17 mm squared petri dish for agarose pads |
BD Bacto Casitone | Becton Dickinson | 225930 | Casitone |
Parafilm M | VWR | 291-1213 | Parafilm |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Carl Roth | AE15.2 | Tris |
Magnesium sulphate heptahydrate | Carl Roth | P027.2 | Magnesium sulphate |
Potassium dihydrogen phosphate p.a. | Carl Roth | 3904.1 | Potassium dihydrogen phosphate |
1% CTT medium: 1 % (w/v) BD Bacto™ casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4 | Cultivation medium for M.xanthus | ||
TPM buffer: 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4 | Buffer for preparation of microscopy slides for M.xanthus |