Her presenterer vi en protokoll for live-imaging såret reparasjon og tilknyttede inflammatorisk respons på spatio-temporale høyoppløselig i vivo. Denne metoden bruker pupal utviklingstrinn Drosophila aktivere langsiktige imaging og sporing av bestemt celle populasjoner over tid og er kompatibel med effektiv RNAi-mediert genet inaktivering.
Under rask inflammatorisk respons til å ødelegge vev rekrutteres raskt cellene av medfødte immunforsvaret til skade området. Når på såret, medfødte immunceller utfører en rekke viktige funksjoner, for eksempel kampene infeksjon, fjerne nekrotisk rusk og stimulere matrix deponering. For å forstå ulike signalnettverk hendelsene som regulerer denne immunrespons, er det avgjørende å observere kompleks oppførsel av (og samhandlinger som oppstår mellom) flere celle linjene i vivo, og i sanntid, med høy spatio-temporale oppløsning. Den optiske gjennomskinnelighet og den genetiske tractability av Drosophila embryo har etablert Drosophila som en uvurderlig modell til live-image og dissekere grunnleggende aspekter av inflammatoriske celle opptreden, inkluderer mekanismer utviklingsmessige spredning, rydding av apoptotisk lik og/eller mikrobiell patogener og rekruttering til sår. Men flere nyere arbeider har nå vist at ansette et mye senere tidspunkt i Drosophila livssyklus- Drosophila puppe-tilbyr en rekke forskjellige fordeler, inkludert forbedret RNAi effektivitet, lengre imaging perioder, og betydelig større immun cellen tallene. Her beskriver vi en protokoll for bildebehandling såret reparasjon og tilknyttede inflammatorisk respons på høy spatio-temporale oppløsningen i live Drosophila pupae. For å følge dynamikken i både re epithelialization og betennelse, bruker vi en rekke spesifikke i vivo fluorescerende markører for både epitel og medfødte immunceller. Vi også demonstrere effektiviteten av foto-cabriolet fluorophores, for eksempel Kaede, for å følge bestemte immun celle undergrupper, for å spore deres atferd som de migrerer til og løse fra skade området.
En effektiv inflammatorisk respons er viktig for noen organismer å bekjempe infeksjoner, fjerne rusk og organisere reparasjon av skadet vev1. Selv om dette svaret er en uunngåelig resultat av de fleste vevsskade, krever betennelse strenge reguleringer fordi en upassende betennelsesreaksjon har vært knyttet til en rekke ulike menneskelige sykdommer (inkludert kronisk ikke-healing sår, overdreven scarring og predisposition til kreft)1,2,3. Gitt denne kliniske relevans, er det avgjørende å få en mer detaljert forståelse av mobilnettet og molekylære mekanismer kjøring inflammatorisk respons for å utvikle nye prognostiske indicators og strategier for å behandle en rekke kronisk inflammatorisk forhold som kan beskytte reparasjon vev fra lengre og unødvendig betennelse.
De siste årene blitt Drosophila en godt etablert og verdifulle modellsystem å dissekere grunnleggende funksjonene til betennelsesreaksjon bevart fra insekter til menneskelig4,5. I dag tilbyr Drosophila langt større genetisk tractability enn det som er mulig i andre eksperimentelle modeller (som mus eller sebrafisk), tillater presis spatio-temporale genetisk manipulasjon i vivo (å deaktivere eller over express noen genet av interesse i spesifikke celletyper på en definert utviklingsmessige tidspunkt) og brukervennlighet genomet hele skjermer6,7. Tradisjonelt er de fleste live-imaging studier av sårheling og betennelser i Drosophila utført på embryonale stadier, embryoer er immobile (i motsetning til Drosophila larver eller voksne) og optisk gjennomsiktig som gjør at enestående høy oppløsning i vivo imaging8. Dette har tillatt forskere å visualisere raske og robuste rekruttering av Drosophila medfødte immunceller (hemocytes) til såret området i respons til mekanisk eller laser-indusert skade embryonale epitel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. ved å kombinere disse live-imaging studier med genetisk manipulering, studier i Drosophila embryoer har avdekket mange viktige immun celle proteiner som styrer inflammatorisk celle atferd i vivo. For eksempel CED-1 homolog Draper (en ITAM domenet inneholder protein) har blitt identifisert som en viktig “skade reseptor” som formidler rekruttering Drosophila immunceller i en H2O2-avhengige måte til områder av skade15. Draper nivåer i immunceller reguleres igjen av kalsium-indusert JNK signalering og opphøyet nedstrøms apoptotisk lik opptak12. Hemocyte motilitet videre krever kompleks cellen cytoskjelett endringer å koordinere regisserte migrering mot såret og dette er avhengig av aktiviteten av cellen cytoskjelett regulatorer som utgangen-bunting protein Fascin16 og Rho familien liten GTPases Rac og Rho9.
Drosophila er en holometabolous insekt som går gjennom flere larver og pupal stadier følgende embryogenesis, før nå voksen alder17. Drosophila puppen er utviklet som en ekstra modell for ikke-invasiv live-imaging av en rekke dynamisk mobilnettet begivenheter, inkludert utviklingsmessige celle migrasjon18, celledeling19, celle vekst20og muskel sammentrekning21. Nylig har det blitt etablert som en ny modell i å studere dynamikken i såret reparasjon og betennelse i vivo22,23.
Akkurat som embryonale stadier er Drosophila pupae immobile og optisk gjennomskinnelig, etter forsiktig disseksjon deres ugjennomsiktig pupal tilfeller18. Ved å utnytte denne optiske gjennomsiktighet, kan man følge virkemåte i vivo medfødte immunceller (hemocytes) svar vevsskade i Drosophila pupal vev, som pupal fløyen22. Den pupal vingen eksisterer som en enkel bilayered struktur og består av to store flate epithelial ark er tilkoblet rundt fløyen periferien; den ekstracellulære plassen mellom disse to epiteliale lag er fylt med hemolymph (insekt blod) og stort antall motile hemocytes24. Akkurat som i embryo utløser mekanisk eller laser-indusert skade fløyen epitel en raske rekrutteringen av hemocytes til skade området23. Men tilbyr denne pupal scenen noen klare fordeler for bildebehandling over tidligere embryonale stadier. Skadet pupae kan avbildes over langt lengre tidsrom (for minst 5 h), flere vev er tilgjengelig for eksperimentell forstyrrelsene (for eksempel generering av flere sår) og det er betydelig større antall hemocytes tilstede ved dette stadiet ( gi mer celle baner fra lengre avstander for forbedret statistisk styrke under matematiske analysen). Videre forbedret effektiviteten i RNAi-mediert genet inaktivering betydelig pupal etapper, slik at mange gener å være ‘banket-ned’ i en vev eller tid-spesifikk måte sammenlignet med de mer tradisjonelle hele mutant tilnærmingen av embryo.
For å kunne følge dynamikken i såret re epithelialization og tilhørende inflammatorisk respons innen denne pupal modellen, to ulike celle populasjoner må merkes: pupal epitel og cellene av medfødte immunforsvaret (Drosophila hemocytes). En rekke forskjellige indikatorer (Tabell for materiale) er tilgjengelig til å merke disse to ulike celle populasjoner – valg av markøren, avhenger av det detalj forarbeide å bli undersøkt. For å markere pupal epitel, Drosophila linjer som inneholder enten benyttes en overalt uttrykt GFP-merket E-cadherin (som merker adherens veikryss) rutinemessig for å angi plasseringen av cellemargene, eller eventuelt en GFP-merket Utgangen-bindende domenet til Moesin (som merker begrepsordbok cytoskeleton) å visualisere de sår-edge kontraktile utgangen ring og ledende utstikkende deler. Merke Drosophila hemocytes, en hemocyte-spesifikke srp-Gal425 til stasjonen uttrykk for kjernefysisk RFP (for kjernefysisk sporing), cytoplasmatiske GFP eller GFP-merket Moesin (etikett cytoplasma eller utgangen cytoskjelett, henholdsvis) eller en photoconvertible fluorophore (for eksempel Kaede) brukes. Faktisk er det ofte en fordel å bruke flere immun celle markører i kombinasjon, aktivere samtidig analyse av kjernefysiske bevegelsen og celle morfologi (se representant resultater). Men siden denne protokollen innebærer bruk av Drosophila pupae, bare kombinasjoner av genetiske markører som er levedyktig til midt-pupal stadier kan benyttes. Også kan embryonale dødelige aksjer ikke egnet. Dette er usannsynlig å være et problem når imaging kontroll (eller vill-type) pupae men er viktig å vurdere når gener er å bli slått ned eller overexpressed, for å vurdere deres effekt på såret nedleggelse eller betennelse. Ved tidlig dødelighet forårsaket av genet knockdown (eller overuttrykte), en Gal80ts konstruere kan brukes å indusere Gal4-drevet knockdown senere i utvikling (se diskusjon).
I våre studier, har flytte til pupal scenen hjulpet oss å samle tilstrekkelig immun cellen bane data å analysere inflammatorisk atferd med avansert matematisk modellering, som i sin tur har tillatt oss å utlede romanen detaljer av såret inflammatorisk attractant signaler23. For eksempel viste denne tilnærmingen at såret chemoattractant sprer seg langsomt gjennom betent vev på 200 μm2/minutt en pris langt tregere enn tidligere foreslått liten kandidat molekyler som ATP eller H2O2 rapporteres til Diffus26,27,28,29; disse små “skade” molekylene er i stedet vil fungere som ettergivende signaler. Videre ved å følge langsiktige virkemåten for medfødte immunceller som de løse fra et innledende sår og er utsatt for et sekund (laget i forskjellige timepoints etter først), har vi avdekket en midlertidig ‘desensitization”perioden som immunceller er blind påfølgende skader23. Ved å utnytte langsiktige tenkelig potensialet av pupal modellen, sammen med Drosophilas genetisk tractability, kan man følge virkemåten til bestemte immun celle populasjoner (for eksempel bare de immunceller rekruttert til såret området) i svar på etterfølgende fornærmelser, bruker photoconvertible fluorophore30 som kan uttrykkes utelukkende innenfor immun celle avstamning23.
Her beskriver vi en protokoll for å visualisere dynamikken i såret reparasjon og tilknyttede inflammatorisk respons på høy spatio-temporale oppløsning med levende Drosophila pupae. Vi gir en detaljert metodikk for å dekke trinnene som kreves for første pupae utarbeidelse (disseksjon og montering) og påfølgende laser-mediert såret og tidsinnstilt bildebehandling. Vi beskriver også bruk av foto-cabriolet fluorophores å tillate merkingen av bestemt immun celle delsett i vivo. På lang sikt ser vi at denne Drosophila pupal modellen åpner spennende muligheter for dissekere komplekse signalnettverk dynamikken underliggende betennelsesreaksjon til å ødelegge vev. Ved å bruke mer avanserte statistiske analyser kan en avdekke funksjoner i svaret som ellers ville være eksperimentelt utilgjengelige, mens forbedret RNAi effektiviteten kunne låne seg anvendelsen av genomet hele screening i immunceller i vivo identifisere romanen spillere regulere immunsystemet celle atferd.
Akutt betennelsesreaksjon til å ødelegge vev er en kompleks og svært dynamisk prosess som er avgjørende for å organisere reparasjon av skadet vev, inkludert avstanden nekrose rusk og kampen mot infeksjon. Du forstår og avdekke grunnleggende aspekter av dette svaret, er det avgjørende at studier utført i vivo på 3-dimensjonale living prøver for at nøyaktige virkemåten og interaksjoner av de ulike celle overleveringslinjer involvert følges nøyaktig over tid. Analyse i sanntid av denne cellen dynamikken kan nærmere karakteristikk av mutant fenotyper enn statisk enkelt tidspunkt fra fast prøver med klassiske immunohistochemistry teknikker. Tradisjonelt har har de fleste live-imaging studier med genetisk medgjørlig Drosophila modellen brukt embryonale utviklingstrinn fruitfly pga optisk gjennomskinnelighet og ubevegelighet forhold til senere utviklingsstadier4 , 5. men nylig vår gruppe og andre har utviklet Drosophila puppe som roman modell å utføre høy oppløsning og langsiktig imaging såret reparasjon og betennelse samtidig i vivo8,22 ,23. Denne nye tilnærmingen tilbyr en spennende langsiktige potensialet for unraveling grunnleggende aspekter av inflammatoriske cellen og videre kan tilpasses for å undersøke den dynamiske oppførselen til andre cellen linjene (for eksempel Drosophila adipocytter 38) etter vev skade.
Det er flere viktige faktorer i forberedelse og avbilding av sårede Drosophila pupae som bestemmer kvaliteten på bildebehandling resultater beskrevet ovenfor. Uten tvil er det vanskeligste trinnet beskrevet protokollen forsiktig disseksjon og nøyaktig posisjonering av pupae før såret og bildebehandling. Pupae på denne utviklingen scene er ekstremt skjøre og selv mindre skader til pupae i forberedelser fasen vil betydelig svekke eksperimentet. noen pupae som kanskje har vedvarende utilsiktet skade må slettes fra eksperimentet siden skade kunne aktivere sin egen inflammatorisk respons, som kan føre til mer utbredt (eller selv systemisk) effekter på inflammatorisk celle oppførsel andre steder i puppen. Pågående utbygging av pupae benyttet i disse eksperimentene (som er under betydelig vev rearrangements for å forberede vev voksen), noen ganger pupae flyttes i løpet av tenkelig. Pupal ruller er, imidlertid, oppstår vanligvis hvis pupae ikke har blitt montert riktig med flateste overflaten av vingen (eller andre vev avbildes) i direkte kontakt med coverglass; Bruk av heptane lim å stabilisere pupae på dekket glasset skal minimere denne uønskede bevegelsen. Derfor må stor forsiktighet også tas dislodging pupae fra sine nøye justert posisjoner når du flytter prøvene mellom mikroskop; ideelt sett knyttet såret laser til samme mikroskopet påfølgende tidsinnstilt bildebehandling og foto-konvertering.
I tillegg kan ferdighet av pupal disseksjon og montering trinn, vil nøyaktig genotype av de Drosophila pupae brukes ha en betydelig effekt på kvaliteten på bildebehandling data generert. For eksempel avgjør hvor mange eksemplarer av Gal4 fører og UAS konstruksjoner (f.eks UAS-GFP eller UAS-Kaede) i en enkelt pupal genotype signal-til-støy-forhold under påfølgende bildebehandling. Som regel flere eksemplarer av et Gal4 eller UAS konstruere stede, jo større den totale mengden fluorescerende protein (f.eks GFP eller Kaede) i vevet. Det optimale nivået på fluorescerende protein vil imidlertid være en forsiktig balanse mellom heve vev fluorescens tilstrekkelig å tillate høykvalitets tenkelig (bruk av lavere laser krefter, reduksjon i photobleaching og imaging over lengre tid perioder) men uten å forårsake fluorophore-indusert mobilnettet toksisitet; det optimale antallet Gal4 og UAS konstruksjoner i hvert eksperiment vil variere i henhold til bestemte drivere og fluorophores brukes. Forsiktighet bør utvises å heve pupae ved 25 ° C (eller høyere, opptil 29 ° C) fordi Gal4-UAS systemet er ømfintlig og vil være ineffektiv ved lavere temperaturer31. For å oppnå flere nivåer av kontroll over vev eller tid-spesifisitet av Gal4 –drevet uttrykk, kan Gal4-UAS systemet repressor Gal80 også være inkludert i pupal genotype39. Gal80 kan enten brukes til å undertrykke Gal4 aktivitet innenfor et bestemt vev (med en vev-spesifikk Gal80) eller på et bestemt tidspunkt (med en temperatur sensitive Gal80). Gal4-UAS systemet kan videre kombinert med andre uavhengige binære systemer (som Meglos –lexAop og QF –QUAS -systemer) for å generere Drosophila som har flere konstruksjoner (f.eks fluorophores, RNAi linjer eller andre genetisk konstruksjoner) uttrykt samtidig i en rekke forskjellige vev39.
Bruk av denne nye Drosophila pupal modellen tilbyr en rekke fordeler fremfor den mer tradisjonelle tilnærmingen for fosteret. Sammenlignet med den kortsiktige imaging (opptil 3 h) tilgjengelig i SS15 embryoer (scenen som mest embryonale såret studier er utført), pupae kan avbildes over betydelig lengre perioder (i prinsippet til voksen etter 96 h pupal utvikling ). Videre langt større antall hemocytes (Drosophila medfødte immunceller) er tilstede i pupal vev (og tilgjengelig for imaging) sammenlignet med mer begrenset antall stede i fosteret og dette har tillatt oss å samle betydelig mer bildebehandling data på hemocyte atferd med samme antall eksemplarer. Avgjørende, har det, i sin tur gitt oss bruke mer avanserte matematisk modellering for å analysere hemocytes atferd og ekstra romanen funksjoner i såret Oktenol og betennelsesreaksjon som ville ellers ha forblitt eksperimentelt utilgjengelig23. En annen fordel av pupal modellen er at RNAi-mediert genet knockdown er betydelig mer effektiv enn på tidligere embryonale stadier, gir bedre analyse av vev eller tid-spesifikke genet inaktivering bruker binære systemer som Gal4-UAS systemet 39. effektiviteten av RNAi på dette stadiet dermed åpner muligheten å utføre storskala (eller selv upartiske genomet-bred) RNAi skjermer for å søke etter nye spillere involvert i såret reparasjon eller inflammatorisk celle atferd.
Imidlertid Drosophila pupae klart kan ikke brukes til å studere av fenotyper som følge av genetiske mutasjoner som embryonale dødelige; funksjonelle og live-imaging studier av gener som er avgjørende for embryonale utvikling må derfor fortsatt utføres i embryoer, med mindre RNAi-mediert genet knockdown en eller vev-spesifikk måte tillater utvikling skal skje gjennom til pupal stadier. Fosteret også fortsatt av valg å studere og live-image visse funksjoner i immun celle atferd, inkludert utviklingsmessige utbredelse av immunceller fra deres opprinnelse, kontakt-hemming av bevegelse og fagocytose av apoptotisk lik generert under utviklingsmessige vev sculpting5,8 som ennå ikke vært observert i pupal modeller. Selv om studier i Drosophila larver og voksne har gitt en viktig innsikt mekanismene bak såret reparasjon og betennelse40,41,42,43, 44 live-imaging studier på disse stadiene har vist vanskelig på grunn av den iboende mobil innholdet i prøvene. Mens Larvene kan være anesthetized for å tillate korte perioder av live bildebehandling, på grunn av midlertidige natur av bedøvelsen, bare kort øyeblikksbilder av live såret reparere eller betennelsesreaksjon kan bli visualisert45. En fersk studie har nå utviklet en forbedret protokoll som tillater langsiktige avbilding av larver sårheling46, selv om forberedelse og tenkelig fortsatt er betydelig mer utfordrende enn i embryo eller pupae. På lang sikt ser vi at ved å benytte den mest passende utviklingsstadiet for å løse hver spesifikke spørsmål, studier i alle fire av disse forskjellige Drosophila stadier – fra embryo gjennom larver og pupal perioder til voksen (hver med sine egne unike fordeler og begrensninger) – vil gi supplerende kunnskaper om molekylære og mobilnettet mekanismen såret reparasjon og betennelse.
I fremtiden denne protokollen for såret og langsiktig bildebehandling av Drosophila pupae lett kan tilpasses å studere en rekke betennelse-lignende fenomener og har omfattende muligheter for avdekke romanen funksjoner av inflammatoriske såret respons. Kombinasjonen av langsiktig bildebehandling, sammen med bruk av photoconvertible fluorophores (for eksempel Kaede), er av stor verdi for å forstå dynamikken i medfødte immunsystemet celle atferd og spesielt langt mindre forstått oppløsning fasen av såret betennelsesreaksjon. Ved spesielt merking individ eller subpopulasjoner av immunceller (som de rekruttert til et sår) vil det være mulig å analysere hvordan eksponering for en miljømessig stikkordet (for eksempel lik eller skade) påvirker immun cellens påfølgende svar senere signalet. Inflammatorisk virkemåten til Drosophila hemocytes kan endres ved tidligere erfaringer – for eksempel de er primet for å svare på vev skade av tidligere fagocytose av apoptotisk lik under utvikling12 men det gjenstår å se om andre miljømessige stikkordene indusere lignende grunning hendelser. Selv om studier av pupal sår hittil har fokusert på medfødte betennelsesreaksjon, den pupal vinge modellen også gir en ideell mulighet til både live-image og analysere mekanismene bak epithelial såret reparasjon. Dessuten, denne pupal bildebehandling metode kan også tilpasses for å undersøke den dynamiske oppførselen av andre cellen overleveringslinjer svar på vev skade38, enten i den pupal vingen selv eller andre lett tilgjengelig pupal vev (som øyne, ben eller syn). Til slutt, ved å kombinere den genetiske tractability av Drosophila med enkel langsiktige pupal imaging, romanen epithelial reparasjon eller inflammatorisk regulatorer kunne avdekket gjennom anvendelse av upartiske genomet hele sammenleggbare tilnærminger.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke medlemmer av Martin, Nobes, Richardson og tre laboratorier for nyttig diskusjon. Vi takker også Wolfson Bioimaging anlegget (University of Bristol, UK), Bloomington lager sentrum (Universitetet i Indiana, USA) og Vienna Drosophila Kompetansesenteret ( Drosophila aksjer) og Flybase (for oppdatert Drosophila gene merknader). Dette arbeidet ble støttet av MRC prosjekt stipend pm og ww (MR/J002577/1), en Wellcome Trust Senior fellesskap til ww og en Wellcome Trust etterforsker Award PM.
Drosophila stocks | |||
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII) |
Kyoto Stock Center, DGRC | #109007 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III) |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #58742 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #59023 | The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T. |
hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4; |
Generated by Katja Bruckner | Generated by Katja Bruckner | Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004). |
UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #8545 or #8547 | UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal |
UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | Multiple stocks available (e.g. #1522) | Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness. |
UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #26161 | Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV. |
GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #57145 | The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ingredients for fly food media | Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.) | ||
maize | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
soya flour | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
malt extract | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
molasses | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
Difco agar | BD Biosciences, Fisher Scientific | DF0142-15-2 | For preparation of fly food |
Propionic acid | Sigma | 402907 | For preparation of fly food |
Nipagen | Sigma | 79721 | For preparation of fly food |
Dried baker's yeast | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | For preparation of fly food |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sample preparation and mounting | |||
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | For preparation of heptane glue |
Fine sable paintbrush | Daler-Rowney (or equivalent) | #0 or 1 | |
Forceps | Fisher Scientific (or Fine Science Tools) | NC9404145 | Dumont #5 |
Glass bottomed dishes for imaging | MatTek | P35G-0-10-C | We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment. |
Heptane | Sigma | 51730-5ML | For preparation of heptane glue |
Double sided sticky tape (e.g. Scotch) | Agar Scientific | AGG263 | For preparation of heptane glue |
50ml tube (for heptane glue) | Falcon tubes from Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparation of heptane glue |
Glass microscope slides | Agar Scientific | AGL4244 | For dissection of Drosophila pupae |
Dissecting stereo microscope with brightfield | Leica (or equivalent) | M50 | For dissection of Drosophila pupae |
Microscissors | John Weiss International | 103123 | Miniature Research Scissors (straight) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Laser ablation and imaging | |||
Nitogen ablation laser | Spectra-Physics (or Andor equivalent) | Model VSL-337ND-S | For wounding, this should be attached to a widefield imaging system |
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) | Leica (or equivalent) | TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) | Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal) |
Environmental chamber | Life Imaging Services (or equivalent) | "Microscope Temperature Control System" | Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Image Analysis Software | |||
FRAP software module | Leica (or equivalent) | CLSM FRAP software module | For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede |
ImageJ (image analysis software) | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012. |
ImageJ plugin "Manual Tracking" | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.net/Manual_Tracking | |
ImageJ plugin "TrackMate" | ImageJ, NIH | https://imagej.net/TrackMate | Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081 |
Volocity (high performance 3D imaging software) | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | For image analysis |
IMARIS (image analysis software) | Bitplane | IMARIS for Cell Biologists | For image analysis |