हम एक कुशल और अभिकर्मक और लाइव सेल इमेजिंग के लिए zebrafish भ्रूण के प्राथमिक सेल संस्कृतियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वयस्क zebrafish मस्तिष्क से प्राथमिक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार करने के लिए उपयोग में आसान प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Zebrafish भ्रूण पारदर्शी और मां के बाहर तेजी से विकसित कर रहे हैं, इस प्रकार एक बरकरार है और विकासशील हड्डीवाला में गतिशील जैविक प्रक्रियाओं के vivo इमेजिंग में उत्कृष्ट के लिए अनुमति देता है । हालांकि, विशिष्ट कोशिका प्रकार और सेलुलर संरचनाओं के morphologies की विस्तृत इमेजिंग पूरे mounts में सीमित है । इसलिए, हम zebrafish भ्रूण और वयस्क ऊतक से संस्कृति रहते प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एक कुशल और आसान करने के लिए उपयोग प्रोटोकॉल की स्थापना की ।
संक्षेप में, 2 dpf zebrafish भ्रूण dechorionated, विअसंबद्धी, निष्फल, और collagenase के साथ एकल कोशिकाओं को कर रहे हैं । एक निस्पंदन कदम के बाद, प्राथमिक कोशिकाओं कांच नीचे व्यंजन पर चढ़ाया जाता है और कई दिनों के लिए खेती की जाती है । ताजा संस्कृतियों, जितना दीर्घकालिक differenciated वाले, उच्च संकल्प फोकल इमेजिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । संस्कृति विभिंन प्रकार के सेल शामिल हैं, धारीदार myocytes और न्यूरॉन्स के साथ पाली पर प्रमुख जा रहा है-L-lysine कोटिंग । करने के लिए विशेष रूप से फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन द्वारा सेलुलर संरचनाओं लेबल, हम भी एक electroporation प्रोटोकॉल जो विभिंन प्रकार के सेल में प्लाज्मिड डीएनए के अभिकर्मक की अनुमति देता है की स्थापना की, ंयूरॉंस सहित । इस प्रकार, ऑपरेटर परिभाषित उत्तेजनाओं की उपस्थिति में, जटिल सेल व्यवहार, और प्राथमिक zebrafish कोशिकाओं के intracellular गतिशीलता उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा, वयस्क zebrafish मस्तिष्क का उपयोग करके, हम बताते है कि वर्णित पृथक्करण तकनीक, साथ ही साथ बुनियादी संवर्धन शर्तों, वयस्क zebrafish ऊतक के लिए भी काम करते हैं ।
zebrafish (ढाणियो rerio, D. rerio) बुनियादी और जैव चिकित्सा अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए एक लोकप्रिय मॉडल हड्डीवाला है1. Zebrafish भ्रूण तेजी से पूर्व uteroका विकास, पारदर्शी हैं, और एक खुर्दबीन के नीचे फिट, इस प्रकार एक जीवित जीव में हड्डीवाला विकास के अध्ययन के लिए उत्कृष्ट आवश्यकताएं प्रदान करते हैं । zebrafish2के आनुवंशिक पथ की वजह से, सेल प्रकार के साथ कई स्थिर ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों-विभिंन फ्लोरोसेंट मार्करों की विशिष्ट अभिव्यक्ति विशिष्ट कोशिका आबादी के अवलोकन के लिए अनुमति की स्थापना की गई है । zebrafish समुदाय तथाकथित Gal4 की एक व्यापक विविधता प्रदान करता है-चालक लाइनों जो एक सिंथेटिक Kal4TA4 (या KalTA3-समकक्ष GalFF) जीन Gal4-डीएनए-खमीर के बंधन डोमेन वायरल transcriptional सक्रियकरण से जुड़े के साथ एक transgene व्यक्त ले सेल प्रकार विशिष्ट बढ़ाने के नियंत्रण के अंतर्गत डोमेन । ये चालक लाइनें जो एक परिभाषित ऊपर से मिलकर transgenes ले प्रभाव लाइनों को पार कर रहे है अनुक्रम को सक्रिय (यूएएस) एक रिपोर्टर जीन से जुड़े । Kal4TA4 प्रोटीन यूएएस तत्व को बांधता है, इस प्रकार सेल प्रकार-रिपोर्टर जीन3,4के चयनात्मक अभिव्यक्ति सक्रिय । इस दृष्टिकोण लगभग सभी उपलब्ध बढ़ाने और डबल ट्रांसजेनिक जानवरों में रिपोर्टर तत्वों के अत्यधिक विविध मिश्रित अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।
हालांकि, में गहराई से लाइव इमेजिंग व्यक्तिगत कोशिकाओं या उनके सेलुलर सामग्री पर ध्यान केंद्रित के साथ एक पूरी में सीमित है और लगातार भ्रूण बदल रहा है । सबसे अधिक संकल्प के साथ विशिष्ट कोशिका जैविक प्रश्नों के समाधान के लिए, सेल संस्कृतियों के उपयोग अक्सर बेहतर है । zebrafish के कुछ सेल लाइनें मौजूद हैं, लेकिन वे के रूप में भारी चुना5,6,7 और उनके प्रचार अक्सर समय लेने वाली है माना जाता है । इसके अलावा, सभी उपलब्ध सेल लाइनों fibroblast प्राप्त कर रहे हैं, कोशिकाओं के एक प्रकार के लिए सेल संस्कृति का उपयोग प्रयोग सीमित । इसलिए, हम स्थापित दोनों एक कुशल और आसान करने के लिए उपयोग प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण और वयस्क zebrafish मस्तिष्क से सीधे प्राथमिक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, एक साथ दृष्टिकोण के साथ संस्कृति की दीर्घायु बढ़ाने के लिए और खेती की विविधता को व्यापक कक्ष प्रकार । इसके अलावा, हम अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण प्राथमिक कोशिकाओं transfect फ्लोरोसेंट organelle मार्कर के लिए निर्माण करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । इस प्रकार, सेलुलर morphologies और सेलुलर संरचनाओं अलग कोशिका प्रकार है जो उनके प्रमुख सुविधाओं को बनाए रखने में उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ विश्लेषण किया जा सकता है ।
यहां, हम या तो 2 dpf zebrafish भ्रूण या वयस्क zebrafish मस्तिष्क से संस्कृति प्राथमिक कोशिकाओं के लिए दो अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
2 dpf zebrafish से प्राथमिक सेल संस्कृतियों की तैयारी अपेक्षाकृत बुनियादी स…
The authors have nothing to disclose.
हम Fritsch, ए. भेड़िया-Asseburg, Linde और एस.-एम । उत्कृष्ट पशु देखभाल और तकनीकी सहायता के लिए Tokarski । हम गहन और उपयोगी विचार विमर्श के लिए Köster लैब के सभी सदस्यों के लिए आभारी हैं । हम आभार ड्यूश Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) और लोअर Saxony, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) के संघीय राज्य द्वारा धन स्वीकार करते हैं ।
Fish lines | ||||||
AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Equipment | ||||||
centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
micro pipettes | Gilson | |||||
sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Software | ||||||
Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Plasmids | ||||||
pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Plastic and glass ware | ||||||
BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Chemicals and Reagents | ||||||
sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Enzymes | ||||||
collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Medium and solutions for cell culture | ||||||
1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |