Biolumineszente Bakterien regulieren Licht Produktion durch eine Vielzahl von Mechanismen, wie z. B. Quorum sensing. Diese neuartige Methode ermöglicht die in Situ -Untersuchung von Biolumineszenz und die Korrelation der Lichtemission, Zelldichte. Eine künstliche Biolumineszenz Escherichia coli System ermöglicht die Charakterisierung des Lux -Operons, Lux Proteine und deren Zusammenspiel.
Es gibt eine beträchtliche Anzahl von Bakterienarten Licht emittieren. Sie alle teilen die gleiche gen-Cluster, nämlich die Lux Operon. Trotz dieser Ähnlichkeit zeigen diese Bakterien extreme Schwankungen in Eigenschaften wie wuchsverhalten, Intensität der Lichtemission oder Regulierung der Biolumineszenz. Die hier vorgestellte Methode ist ein neu entwickeltes Assay, der Aufnahme von Zellwachstum und biolumineszenten Lichtemission Intensität im Laufe der Zeit unter Verwendung eines Platte Lesers kombiniert. Die daraus resultierende Wachstum und Lichtemission Merkmale können auf wichtige Merkmale der jeweiligen Bakterienstamm, z. B. Quorum-sensing-Regelung verknüpft werden. Der Anbau einer Reihe von biolumineszenten Bakterien erfordert ein spezifisches Medium (z. B. künstliche Meer Wasser Medium) und definiert Temperaturen. Die einfach zu handhaben, nicht-biolumineszenten Standard-Forschung Bakterium Escherichia coli (E. Coli), können auf der anderen Seite kostengünstig in hohen Stückzahlen im Labormaßstab kultiviert werden. Nutzung von E. Coli durch die Einführung einer Plasmid enthält das gesamte Lux Operon Versuchsbedingungen zu vereinfachen und zusätzlich eröffnet viele Möglichkeiten für zukünftige Anwendungen. Der Ausdruck aller Lux Gene unter Verwendung einer E. Coli Ausdruck Belastung erzielte Bau ein expressionsplasmid über Gibson Klonen und Einfügung von vier Fragmente mit sieben Lux Gene und drei Rippe Gene die Lux-Rib -Operon in einen pET28a-Vektor. E. Coli basierte Lux Genexpression induziert und über Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) Addition führt Biolumineszenz E. Coli gesteuert werden kann Zellen. Die Vorteile dieses Systems sind zu vermeiden, Quorum-sensing-Verordnung Beschränkungen und komplexe mittlerer Kompositionen zusammen mit nicht standardmäßigen Wachstumsbedingungen, wie z. B. Temperaturen definiert. Dieses System ermöglicht die Analyse von Lux -Genen und deren Zusammenspiel, durch den Ausschluss des jeweiligen Gens aus der Lux Operon oder sogar Zugabe von neuartigen Genen, den Austausch der LuxAB Gene von einem Bakterienstamm durch ein anderes, oder Analyse von Protein-komplexe, z. B. LuxCDE.
Die Emission von Licht durch lebende Organismen (Biolumineszenz) ist ein faszinierender Prozess, die in Bakterien, Pilze, Insekten, Nematoden, Fische und Tintenfische1gefunden. Biolumineszenten Lichtemission ergibt sich aus einem Chemolumineszenz Reaktion in die chemischer Energie in Lichtenergie (“kaltes Licht”) (teilweise) umgewandelt wird. Bei biolumineszenten Bakterien katalysiert die heterodimerisierenden Enzym Luciferase Monooxygenation von langkettigen aliphatischen Aldehyde, wie z. B. Tetradecanal, um die entsprechenden Säuren begleitet von Lichtemission mit einem Maximum an 490 nm2, 3.
Abbildung 1 : Allgemeine Reaktionsschema der bakterielle Luciferase. Die bakterielle Luciferase (LuxAB) katalysiert die Monooxygenation von langkettigen Aldehyden (CH3(CH2)nCHO) durch den Einsatz reduziert Flavin mononukleotid (FMNH2) und molekularer Sauerstoff (O2), wodurch die Produkte lange Kette Säuren (CH3(CH2)nCOOH), Flavin mononukleotid (FMN), Wasser (H2O) und die Emission von Licht zentriert auf 490 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Bei dieser Oxidation freiwerdende Energie bewirkt einen angeregten Zustand FMN-4a-Hydroxid, dient als die Licht emittierende Luciferin4. Die Proteine, die im bakteriellen Biolumineszenz, nämlich LuxCDABEG, von Lux Operon codiert sind und sind über verschiedene Bakterienstämme2,5hoch konserviert. Die Gene LuxA und LuxB kodieren für die Luciferase heterodimerisierenden; LuxC, LuxD desund LuxE Genprodukte sind Bestandteil einer Fettsäure-Reduktase Komplex; und LuxG kodiert für eine Flavin-Reduktase-6. Das zusätzliche LuxF Gen tragen eine Reihe von Biolumineszenz Photobacteria (e.g.,Photobacterium Mandapamensis 27561). Es wurde berichtet, dass LuxF ist ein Homodimeric Protein, das die ungewöhnliche Flavin Derivat 6-(3′-(R)-Myristyl bindet)-FMN (MyrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Weitere Gene identifiziert worden, die verantwortlich sind für die Synthese von Riboflavin (z. B. RibEBH) und außerdem regulatorische Gene berichtet worden, dass eine Rolle bei Quorum sensing Regelung der Biolumineszenz, vor allem für Vibrio Fischeri und Vibrio Harveyi6,13. Trotz der hoch konservierte gen Reihenfolge zeigen biolumineszente Bakterien hohe Temperaturschwankungen in Eigenschaften wie wuchsverhalten, Intensität der Lichtemission oder Regulierung der Biolumineszenz2,5,14 .
Mehrere Stämme oder Plasmide enthalten Teile geändert oder ganze Lux -Operons bekannt sind, nutzen Biolumineszenz als Reporter-Systeme. Verschiedene Anwendungen wie z. B. die Bestimmung promotoraktivität, Überwachung von bakterieller Kontaminationen in Umgebung oder Lebensmittelproben, Biolumineszenz Resonanz Energie Transfer (BRET), in-Vivo Bildgebung von Infektionen in Eukaryonten, pyrosequenzierung usw. waren etablierte15,16,17. Interessant ist, verwendeten die drei am häufigsten Biolumineszenz Reporter, die Systeme von der nordamerikanischen Firefly (Photinus Pyralis), der magensaftresistenten Erreger von Nematoden (Photorhabdus Luminescens) und das Meer Stiefmütterchen (Renilla abgeleitet werden Reniformis). Keines dieser Systeme hat einen bakteriellen Ursprungs, aber die Nutzung von Lux -Genen und Operons bakterieller Herkunft gewinnt mehr Interesse für angewandte Forschung16. Die weniger reichliche Anwendung der Biolumineszenz Proteine aus bakteriellen Quellen ist hauptsächlich auf geringere Stabilität und Langlebigkeit der Bakterien abgeleitet leuchtende Proteine bezogen auf ihre marinen Lebensräumen. Biolumineszente Bakterien mariner Lebensräume sind nicht unter standard Laborbedingungen kultivierbar. Diese Bakterien benötigen spezifische Wachstumsmedien und Bedingungen, wie künstliche Meer mittleren und unteren Wachstum/Inkubation Wassertemperaturen (z. B. 28 ° C).
Zur Vereinfachung der Vergleich von Lux Operon Merkmale oder einzelne Lux Gene einer Reihe von verschiedenen biolumineszenten Bakterienstämme, eine Methode, um Lux Operon Ausdruck und Analyse zu standardisieren ist Voraussetzung. So entstand die Idee das gesamte Lux-Rib -Operon in der Standard-Forschung-Bakterium Escherichia coli (E. Coli) zu integrieren. Zu diesem Zweck Gibson Montage erwies sich als ein nützliches Werkzeug, um mehrere lineare, überlappende Fragmente in einem Expressionsvektor ohne die Notwendigkeit einer spezifischen Restriktionsschnittstellen zu integrieren. Diese Methode ist auch geeignet, wenn DNA-Einsätze zu groß sind (e.g.,P. Mandapamensis 27561 LuxCDABFEG RibEBH; ~ -9 kb-Operon-Größe), über PCR verstärkt werden. Ein Lux Operon kann in mehrere überlappende Fragmente getrennt werden, dann in einem expressionsplasmid zusammengebaut werden und schließlich die Reihenfolge überprüft Montage Produkt kann direkt in eine entsprechende E. Coli umgewandelt werden-System für high-Yield Protein Ausdruck18,19,20. Neben der leicht zu handhaben E. Coli basierte Lux Genexpression blieb eine einfache Methode, die Aufnahme von Zellwachstum und biolumineszenten Lichtemission Kombination hergestellt werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die in Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von biolumineszenten Bakterien.
Die Analyse der Lux Gene und Lux Operon Ordnung und Regulation von verschiedenen biolumineszenten Bakterien mit, auf der einen Seite, eine künstliche Biolumineszenz E. Coli enthält das gesamte Lux-Rippe Operon von P. Mandapamensis 27561 und auf der anderen Seite, eine neu entwickelte Platte Leser Assay kombiniert die in Situ -Aufzeichnung der Zelldichte und Lichtemission, hilft, um weitere Informationen zu den verschiedenen bakteriellen Lux -Systemen zu gewinnen. Diese grundlegenden Charakterisierung und Vergleich von Luciferases und verwandte Enzyme führen zu Alternativen zu den bereits etablierten Reporter-Systemen mit verbesserter Stabilität und Aktivität.
Der Bau einer expressionsplasmid mit vier Fragmente komponieren das gesamte Lux-Rippe -Operon von p. Mandapamensis 27561 wurde über Gibson Klonen erreicht. Dieses E. Coli basierte Lux Genexpression kann E. Coli Zellen Licht emittieren. Quorum-sensing-Regelung und nicht standardmäßige Wachstumsbedingungen zu vermeiden, sind wesentliche Vorteile dieses Systems.
Die Vorteile der Verwendung von Gibson Klonen Strategie sind die einfache Montage von mehreren linearen DNA-Fragmente, hohe Flexibilität und keine Notwendigkeit einer besonderen Beschränkung Seiten18,19,20. Diese Methode ermöglicht auf einfache Weise eine Lux Operon, mit Ausnahme einzelner Gene oder Gen-Cluster oder Einführung neuer Gene oder den Austausch von Genen aus einem Stamm mit einer anderen ändern. Voraussetzung für die Anwendung dieser Methode ist die Verfügbarkeit der jeweiligen Lux Operon Gensequenz. Nur für eine kleine Anzahl von biolumineszenten Bakterien ist die vollständige DNA-Sequenz des jeweiligen Lux Operon bekannt bzw. erhältlich. Viele dieser Sequenzen sind fragmentiert, weil sie mit Schrotflinte Sequenzierung generiert wurden. Bei den untersuchten p. Mandapamensis 27561 die vollständige DNA-Sequenz des Lux Operon ist bekannt und von der NCBI-Gen-Datenbank zur Verfügung (GenBank: DQ988878.2).
Ein entscheidender Schritt in das Protokoll der Versammlung Gibson ist die Berechnung der DNA-Konzentration der einzelnen Fragmente. In der Versammlung Protokoll des Herstellers es empfohlen wurde, 0,2 – 0,5 Pmols und einem Gesamtvolumen von 20 µL für 4-6 Fragmente20,21. In unserem Fall, wo der LuxCDABFEG-RibEBH aus 4 Fragmente besteht, waren die Konzentrationen und Gesamtmengen 0.1 Pmol und 45 µL bzw., je nach den Ertrag der PCR-Produkte. Auf der einen Seite die Konzentration reduziert werden musste und auf der anderen Seite musste die Lautstärke erhöht werden. Dennoch die Montage funktionierte sehr gut und DNA-Sequenzierung bestätigt das korrekte einfügen auf Anhieb. Diese Feststellung bestätigt Gibson Assembly als eine robuste und geeignete Methode für unsere Untersuchungen, die leicht modifizierte18,19,20.
Die neu gegründete Teller-Leser-Assay ist ein einfach zu bedienendes Methode. Es ermöglicht eine einfache primäre Analyse der neu oder (UN-) bekannte Biolumineszenz Bakterienstämme und gibt bereits einen ersten Hinweis auf den regulatorischen Mechanismus der light-Production (z. B. verzögerten Lumineszenz bei niedrigen Zelldichten). Darüber hinaus können Wachstumsbedingungen in Kombination mit leichten Produktion leicht ausgewertet werden, indem einfach Wachstumsmedium oder Temperatur.
Die Messungen mit dem Teller-Leser wurden bei 28 ° C. Der Grund für diese ungewöhnliche Einstellung ist die Temperaturempfindlichkeit der Biolumineszenz Bakterienstämme, wo Temperaturen über 30 ° C zu weniger oder gar keine Wachstum und/oder Lichtemission führen. Beachten Sie, dass die Platte Leser eine definierte Temperatur im Laufe der Zeit mit der Einschränkung von einer fehlenden aktiven Kühlsystem zu halten vermag. Daher muss die Umgebungstemperatur unter die Temperatur der Messung.
Als ein Proof of Concept der Vergleich von E. Coli -Konstrukt mit der Biolumineszenz Belastung p. Mandapamensis (Abbildung 5) auf der einen Seite und die Referenzmessungen (Abbildung 4) auf der anderen Seite wurden durchgeführt und bestätigen die Zuverlässigkeit dieses neu geschaffenen Systems. Darüber hinaus versichert der Langzeitmessung die Langlebigkeit der Lichtemission (Abbildung 6). Aber man muss berücksichtigen, dass OD-Werte nicht zuverlässig über eine bestimmte optische Dichte, abhängig von den Eigenschaften des verwendeten Messgerät (ca. 15 h im vorliegenden Fall) wo eine entsprechende Verdünnung für eine Messung in bräuchte der linearen Bereich des Detektors. Diese hohe Abweichungen im OD-Werte machen diese lange Messungen nicht zuverlässig. Daher sind kürzere Messungen wie 10 h empfohlen, mit dem experimentellen Setup hier berichtet.
Grenzen der etablierten Platte Leser Assay ist in Abbildung 7ersichtlich. Die Schwierigkeit besteht darin, eine geeignete Einstellung der Messung zu finden. Die “Wertschöpfung” regelt die Empfindlichkeit der Foto-Multiplikator-Röhre (PMT). Der Gewinn ist die Verstärkung des Signals in der PMT, was bedeutet, dass das Signal zu ein höheren Gain-Faktor erhöhen wird. Wenn der Gewinn zu niedrig gesetzt ist, wird das Signal-Rausch-Verhältnis größer und Lichtintensitäten von “niedrig” leuchtendes biolumineszenten Bakterien lässt sich nicht mehr (Signale nahe Null, Daten nicht gezeigt) gemessen. Die Herausforderung in einem Biolumineszenz Assay soll die Verstärkung eingestellt, so dass die Messergebnisse für alle Bakterienstämme innerhalb des Bereichs des Instruments bleiben. Darüber hinaus hängt der Messbereich für Lumineszenz Intervall Messzeit (z. B. bis zu 2.000.000 für 1 s).
Der Gewinn wurde auf 2800, festgelegt, die empirisch geprüft und ausgewählt für den spezifischen Platte-Leser für die Einrichtung dieser Methode verwendet wurde. Die verwendeten Gain-Einstellung ermöglicht die Aufnahme von maximal abgestrahlten Lichts durch die Biolumineszenz E. Coli System, p. Mandapamensis 27561 und p. Mandapamensis S1 ohne Überlauf, aber für die Stämme p. Mandapamensis TH1 und V. Harveyi 14126 der Gewinn war zu hoch. Daher diese letzteren Stämme überschreiten die Nachweisgrenze und die reale maximale Lichtintensität nicht gemessen werden kann. Diese technische Einschränkung könnte den Vergleich von biolumineszenten Bakterien vermeiden, die hohe Temperaturschwankungen in der maximale Lichtemission zu zeigen, obwohl Wachstumsbedingungen und Zelldichten vergleichbar sein könnte.
Positionierung der analysierten Bakterienstämme innerhalb der verwendeten well-Platten muss empirisch geprüft werden. Obwohl schwarz-well-Platten mit Glas Böden verwendet wurden, wurde Übersprechen zwischen den Proben beobachtet. Die Lichtintensität des spezifischen Belastungen ist so hoch, dass alle benachbarten Brunnen falsche positive Lichtemissionen (z. B. leer) angezeigt werden. Daher ist es wichtig, zwei verschiedene Stämme entweder separat oder mit einer bestimmten räumlichen Trennung miteinander zu messen.
Es gibt bereits viele geändert E. Coli -Stämme bekannt, die Teile der Lux Operon enthalten und sind vor allem anwendungsorientierte15,16,17. Die hier beschriebenen Methoden darauf abzielen, Grundlagenforschung, zum Beispiel die Möglichkeit der Analyse jedes Lux gen getrennt. Obwohl Forschung der Biolumineszenz eine lange Geschichte hat, gibt es noch viele offene Fragen. Durch Ausschluss eingeschleuste Gene von Lux Operon, den Austausch der LuxAB Gene mit Genen aus einem anderen Stamm oder Analyse von Protein-komplexe, eingebettet in die einfache Handhabung von E. Coli System- und weiter der Platte Leser-Assay, kann es sein, weitere Informationen über regulatorische Prozesse und Funktionen des Lux -Gene zu gewinnen.
The authors have nothing to disclose.
Wir wollen danken Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) für seine Unterstützung beim Aufbau der selbst geschriebenen Skripts für den Teller-Leser. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die österreichische “Fonds Zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung” (FWF), PM (P24189) und das PhD-Programm “DK Molekulare Enzymologie” (W901) bis Uhr.
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |