Frequenti prelievi di punta della coda in topi per la valutazione della secrezione Pulsatile dell'ormone luteinizzante
Summary
Qui presentiamo un protocollo di campionamento di sangue punta della coda per la raccolta del campione di frequente nei topi sfrenati. Questo metodo è utile per la valutazione dei modelli di secrezione pulsatile dell’ormone luteinizzante e potrebbe essere adattato per l’analisi di altri fattori circolanti.
Abstract
In molti sistemi endocrini, ormoni o fattori circolanti non vengono rilasciati continuamente, ma sono secreti come impulsi discreti in risposta ad un fattore di rilascio. Singolo punto di campionamento misure non siano sufficienti comprendere appieno il significato biologico di modello secretivo di ormoni pulsatile o in condizioni fisiologiche normali, o anche durante condizioni della disregolazione. Ormone luteinizzante (LH) è sintetizzata dalle cellule gonadotrope pituitaria anteriore e secreta in un modello pulsatile che richiede frequente raccolta di campioni di sangue per la valutazione del polso. Questo non è stato possibile nei topi fino a recentemente, a causa dello sviluppo di un dosaggio di LH di alto-sensibilità e avanzamento in una tecnica per frequente campionario a basso volume, inizialmente descritto da Steyn e colleghi. 1 qui descriviamo un protocollo per la raccolta del campione di sangue periferico frequenti da topi con sufficiente acclimatazione di movimentazione per rilevare pulsatile secrezione di LH. L’attuale protocollo i dettagli di un periodo di acclimatazione espanso che permette la valutazione di impulsi robusti e continui di LH nel corso di più ore. In questo protocollo, la punta della coda viene ritagliata e sangue raccolti dalla coda utilizzando una pipetta tenuto in mano. Per la valutazione di LH pulsatile in topi gonadectomized, campioni di serie sono raccolti ogni 5-6 minuti per un minimo di 90-180 d’importanza, la raccolta di sangue e misurazione di impulsi robusti di LH può essere realizzati in topi svegli, liberamente si comporta, dati adeguata manipolazione acclimatazione e lo sforzo per ridurre al minimo i fattori di stress ambientale. Sufficiente acclimatazione può essere raggiunto entro 4-5 settimane prima della raccolta del sangue. Questo protocollo evidenzia progressi nella metodologia per garantire la raccolta di campioni di sangue intero per la valutazione dei pattern di secrezione LH pulsatile sopra più ore nel topo, un potente modello animale per la ricerca della neuroendocrina.
Introduction
Funzione della gonade in mammiferi dipende dalla secrezione della gonadotropina, ormone luteinizzante (LH) e follicolo-stimolante ormone, da parte della ghiandola pituitaria. Le gonadotropine sono secernute in entrambi un motivo pulsatile o sovratensioni in risposta alla secrezione ipotalamica di GnRH (GnRH). La sintesi e la secrezione di LH e di FSH sono regolati tramite azione endocrini, paracrini e autocrini da una varietà di molecole tra cui GnRH ipotalamico, ormoni steroidi gonadici e il sistema di activina-inhibin-follistatina, come pure una miriade di condizioni fisiologiche tra cui lo stress e del bilancio energetico. 2
Il modello pulsatile di LH nel sangue nasce da uno scarico piuttosto brusco di LH nel sangue periferico, seguita da circa esponenziale eliminazione. Importanti caratteristiche del modello includono la frequenza di ogni scarico di LH e l’ampiezza della risposta LH, entrambi i quali sono dettati, in parte, dal rilascio di GnRH. dovuta alla difficoltà nel raccogliere il sangue portale ipotalamo-ipofisario per la misura di GnRH pulsante, il campionamento e la misurazione di LH è usata come un proxy GnRH regolazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. Di conseguenza, le informazioni critiche sono codificate nella frequenza e l’ampiezza degli impulsi di LH, che non può essere determinata da un singolo campione.
Analisi della secrezione pulsatile di LH sono stato storicamente limitato ai grandi mammiferi (esseri umani, primati e pecore) a causa del loro sangue grande volume e tolleranza per la raccolta del campione di sangue frequenti. Nei roditori, prelievo di sangue frequenti era limitato al ratto e raggiunto tramite indwelling catetere atriale. 3 , 4 il relativamente basso costo e la disponibilità di genetica (ad es. cre-lox, CRISPR) e manipolazioni complesse circuito neurale (per esempio optogenetica, chemogenetics) rendono topi un organismo modello attraente; Tuttavia, realizzazione di campioni di sangue frequenti e successiva analisi delle concentrazioni di LH è fino a recentemente, dimostrato sfuggente. Tale compito monumentale è stata introdotta da Steyn e colleghi di lavoro. 1 da allora, diversi laboratori hanno iniziato a utilizzare frequenti prelievi e analisi di LH ultra-sensibili per valutare pulsatile secrezione del LH in una varietà di paradigmi sperimentali. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 si noti che il perseguimento di un metodo pratico di raccogliere più campioni di sangue dai topi è stato in corso per almeno 40 anni10 con più perfezionamenti fatto lungo la strada. 11 , 12
Valutazione dei modelli di impulso del LH (cioè frequenza e ampiezza) rappresenta un importante affinamento in monitoraggio secrezione della gonadotropina basale in questo modello animale geneticamente trattabile. Tradizionalmente, le concentrazioni di LH in topi sono state determinate in un campione di sangue. Una debolezza di singolo-punto campioni è un set di dati altamente variabile perché le concentrazioni di LH sono naturalmente fluttuanti durante ogni impulso. Un altro punto debole è che misure isolate perdere intrinsecamente critiche informazioni veicolate dai pattern di secrezione di impulso del LH. Così, un metodo per la raccolta di campioni di sangue frequenti a comportarsi liberamente, topi sfrenati (ad eccezione di manipolazione delicata durante il campionamento) fornirà informazioni avanzate e rivelarsi utili per molti laboratori indagando la regolazione dell’ormone pulsatile.
Qui, descriviamo un protocollo per la raccolta di frequente (ogni 6 min) campioni dai topi svegli, sfrenati di sangue. D’importanza, includiamo una gestione protocollo di acclimatazione che consente per rilevamento affidabile e continuo della secrezione pulsatile di LH in campioni di sangue intero raccolti nel corso di un periodo di tempo in cui pre- e Post-assesment ad una sfida acuta può essere determinato, come la risposta allo stress psicosociale di immobilizzazione e contenimento. Un dosaggio efficace per le concentrazioni di LH da campioni di sangue intero è stato descritto in precedenza; 1 il presente protocollo è focalizzato su un metodo per raccogliere i campioni di sangue per la misura di impulso del LH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un protocollo per la raccolta di sangue frequenti tutta la punta della coda dei campioni di sangue per la valutazione della secrezione pulsatile di LH in topi. Questo protocollo consente il prelievo di campioni per il rilevamento di cambiamenti acuti nella pulsatile secrezione del LH dopo esposizione a stress psicosociale ed è particolarmente adatto per la valutazione degli impulsi LH sotto altre manipolazioni acute o croniche.
Un componente critico di questo protocollo per la…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la d. ssa Jennifer Yang e Kauffman Alexander (Sasha) per assistenza tecnica con questa tecnica, come pure numerose discussioni utili e critiche. Analisi dell’ormone del siero sono state effettuate da Yang et al., 2017 presso The University of Virginia Center for Research in riproduzione Ligand Assay e analisi Core, supportato da Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Fonti di sostegno alla ricerca: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM è stata sostenuta da T32 NICHD 007203.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
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