타악기 황 호르몬 분 비의 평가 대 한 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링을 자주
Summary
여기 억제 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링 프로토콜 자주 샘플 컬렉션에 대 한 선물이. 이 메서드는 타악기 황 호르몬 분 비의 사정 패턴에 대 한 유용 하 고 다른 순환 요인의 분석에 대 한 적응 될 수 있습니다.
Abstract
많은 내 분 비 시스템, 순환 요인 또는 호르몬, 해제 되지 않은 하지만 개별 펄스 방출 요인에 대 한 응답에서으로 분 비 됩니다. 싱글 포인트 샘플링 조치 정상적인 생리 적인 조건 하에서 또는 dysregulation의 조건 중 타악기 호르몬의 분 비 패턴의 생물학적 의미를 완전히 이해 하기에 적당 하지 않습니다. 황 호르몬 (LH)는 앞쪽 뇌 gonadotrope 세포에 의해 합성 하 고 펄스 평가 대 한 빈번한 컬렉션의 혈액 샘플을 필요로 하는 타악기 패턴에서 분 비. 이것은 높은 감도 LH 분석 결과의 발전으로 인해 최근까지 쥐에 가능한 되지 하 고 발전 하는 기술에 자주 낮은 볼륨 샘플 컬렉션, 처음 해당와 동료에 의해 설명. 1 여기 우리 LH의 분 비는 타악기를 검출 하기 위하여 충분 한 처리 순응와 쥐에서 자주 주변 혈액 샘플 컬렉션에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 현재 프로토콜 여러 시간 동안 LH의 강력 하 고 지속적인 펄스의 평가 허용 하는 확장 된 순응 기간을 자세히 설명 합니다. 이 프로토콜에는 꼬리의 끝은 잘리고 휴대용 피 펫을 사용 하 여 꼬리에서 혈액 수집. Gonadectomized 마우스에 타악기 LH의 평가 대 한 직렬 샘플은 중요 한 것은, 90-180 분에 대 한 5-6 분 마다 수집 된 혈액의 수집과 측정 LH의 강력한 펄스의 적절 한 처리를 주어진 깨어, 자유롭게 동작 마우스에서 달성 될 수 있다 순응 그리고 환경 스트레스를 최소화 하기 위해 노력입니다. 충분 한 순응 혈 전에 4-5 주 내에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 마우스, 신경 내 분 비 연구에 대 한 강력한 동물 모델에서에서 여러 시간 동안 타악기 LH 분 비 패턴의 평가 대 한 전체 혈액 샘플의 수집을 위해 방법론에 발전을 강조 한다.
Introduction
포유류의 생식 기능 생식 샘 자극 호르몬 분 비, 황 호르몬 (LH)과 여 포 자극 호르몬, 뇌 하 수 체에서 따라 달라 집니다. gonadotropins는 생식 샘 자극 호르몬-방출 호르몬 (GnRH)의 hypothalamic 분 비에 대 한 응답에서 중 타악기 또는 서 지 방지기 패턴에서 은닉 된다. LH와 FSH의 분 비와 합성 hypothalamic GnRH, gonadal 스테로이드 호르몬 그리고 activin-inhibin-follistatin 시스템으로의 무수 한을 포함 하는 분자의 다양 일 분 비, paracrine 및 autocrine 액션을 통해 통제 된다 스트레스와 에너지 균형을 포함 하 여 생리 적 조건입니다. 2
혈액에서 LH의 타악기 패턴 지 수 제거 약 뒤 말 초 혈액으로 LH의 오히려 갑작스러운 방전에서 발생 합니다. 중요 한 패턴의 기능으로는 각 LH 방전의 주파수 및 LH 응답의 진폭, 둘 다, 부분적으로에 의해 규정 됩니다 hypothalamic-뇌 하 수 체의 측정에 대 한 포털 혈액 수집에 어려움에 GnRH 인해 출시 타악기 GnRH, LH의 측정 및 샘플링 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 GnRH 규제에 대 한 프록시로 사용 됩니다. 따라서, 중요 한 정보는 단일 샘플에서 확인할 수 없는 LH 펄스의 진폭 및 주파수에 인코딩됩니다.
타악기 LH 분 비의 분석 역사적으로 큰 포유 동물 (인간, 영장류, 그리고 양) 그들의 큰 혈액 볼륨 및 빈번한 혈액 샘플 컬렉션에 대 한 내성 때문에 제한 되었습니다. 설치류에 빈번한 혈액 샘플링 쥐에 국한 되었고 내재 심 방 카 테 터를 통해 달성. 3 , 4 상대적으로 저렴 한 비용 및 유전자의 (예: cre-lox, CRISPR) 하 고 복잡 한 신경 회로 (예: optogenetics, chemogenetics) 조작 쥐 매력적인 모델 유기 체; 그러나, 빈번한 혈액 샘플의 달성 및 LH 농도의 후속 분석까지 최근 입증 하기 어려운. 이 기념비적인 작업 해당 및 동료에 의해 개척 되었다. 1 이후 다음, 여러 실험실 자주 혈액 샘플링 및 실험 패러다임의 다양 한 타악기 LH 분 비 평가에 매우 민감한 LH 분석 활용 하기 시작 했다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 그것은 지적 되어야 쥐에서 여러 개의 혈액 샘플을 수집 하는 실용적인 방법 추구 적어도 40의 년10 여러 수정 만든 길을 따라 진행에서 되었습니다. 11 , 12
LH 펄스 패턴 (즉, 주파수와 진폭)의 평가 주요 상세를 모니터링이 유전자 온순한 동물 모델에서 기저 생식 샘 자극 호르몬 분 비를 나타냅니다. 전통적으로, 마우스에 LH 농도 단일 혈액 샘플에서 결정 했다. LH 농도 자연스럽 게 각 펄스 동안 변동 하기 때문에 단일-지점 샘플의 1 개의 약점 높은 변수 데이터 집합입니다. 또 다른 약점은 절연된 측정 본질적으로 LH 분 비는 펄스의 패턴에 의해 전달 하는 중요 한 정보를 보고 싶어요. 따라서, 자유롭게 행동에서 빈번한 혈액 샘플을 수집 하는 방법, 억제 마우스 (샘플링 하는 동안 부드러운 처리) 제외 됩니다 향상 된 정보를 제공을 타악기 호르몬 규칙을 조사 하는 많은 실험실에 유용 합니다.
여기, 우리는 자주의 컬렉션에 대 한 프로토콜을 설명 (매 6 분) 혈액 샘플 깨어, 억제 쥐에서. 우리는 처리를 포함 하는 중요 한 것은, 사전 및 사후 평가 심각한 도전 하는 시간의 길이 확인할 수 있습니다, 동안 전체 혈액 샘플에서 타악기 LH 분 비의 강력 하 고 지속적인 탐지 수집을 허용 하는 순응 프로토콜 같은 동원 정지 및 억제의 사회 심리적인 스트레스에 대응. 전체 혈액 샘플에서 LH 농도 대 한 효과적인 분석 결과 이전; 설명 하고있다 1 이 프로토콜 LH 펄스 측정을 위한 혈액 샘플을 수집 하는 방법에 초점을 맞추고.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기는 쥐에 있는 타악기 LH 분 비의 평가 대 한 전체 혈액 꼬리 팁 샘플의 빈번한 혈액 컬렉션에 대 한 프로토콜에 설명합니다. 이 프로토콜의 사회 심리적인 스트레스에 노출 다음 타악기 LH 분 비의 급성 변화 탐지에 대 한 샘플의 수집을 가능 하 게 하 고 다른 급성 또는 만성 조작에서 LH 펄스의 평가 적합.
LH 펄스의 안정적이 고 강력한 프로필을 달성 하기 위한이 프로토콜?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 박사 제니퍼 양 및 알렉산더 (사샤) 카우 프만이 기술 뿐만 아니라 수많은 도움과 중요 한 토론 기술 지원에 대 한 감사합니다. 혈 청 호르몬 분석 실험 양 그 외 여러분, 복제 Ligand 분석 결과 및 분석 코어, 유 니스 케네디 슈 라이버 NICHD/NIH (NCTRI) 부여 P50-HD28934에 의해 지원 연구에 대 한 버지니아의 대학 센터에서 2017 수행 했다.
연구 지원의 소스: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM T32 NICHD 007203에 의해 지원 되었다.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
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