Hyppige hale-tips blod prøvetaking i mus for vurdering av Pulsatile luteiniserende hormon sekresjonen
Summary
Her presenterer vi en hale-tips blod prøvetaking protokoll for hyppige prøvetaking i hemningsløs mus. Denne metoden er nyttig for vurdering mønstre av pulsatile luteiniserende hormon sekresjon og kan tilpasses for analyse av andre sirkulerende faktorer.
Abstract
I mange endokrine systemer, sirkulerende faktorer eller hormoner er ikke gitt ut kontinuerlig, men utskilles som et diskret puls svar for lanserer. Ett-punkts prøvetaking er utilstrekkelig å forstå biologiske betydningen av sekretoriske mønster av pulsatile hormoner under normale fysiologiske forhold eller under betingelsene i feilregulering. Luteiniserende hormon (LH) syntetiseres av fremre hypofysen gonadotrope cellene og skilles ut i et pulsatile mønster som krever hyppig samling av blodprøver puls vurdering. Dette er ikke mulig i mus til nylig på grunn av utviklingen av en høy følsomhet LH analysen og fremgang i en teknikk for hyppige lavt volum prøvetaking, først beskrevet av Steyn og kolleger. 1 her beskriver vi en protokoll for hyppige perifert blod prøvetaking fra mus med tilstrekkelig håndtering Akklimatisering å oppdage pulsatile utskillelsen av LH. Gjeldende protokollen detaljer en utvidet Akklimatisering periode der vurdering av robust og kontinuerlig pulser av LH over flere timer. I denne protokollen, spissen av halen er klippet og blod samles fra halen bruker en håndholdt pipette. Vurdering av pulsatile LH i gonadectomized mus, seriell prøver er samlet hver 5-6 minutter i 90-180 min. viktigere, innsamling av blod og måling av robust pulser av LH kan oppnås i våken, fritt oppfører mus, gitt tilstrekkelig håndtering Akklimatisering og forsøk på å minimere miljømessige stressfaktorer. Tilstrekkelig Akklimatisering kan oppnås innen 4-5 uker før blod samling. Denne protokollen fremhever den fører å sikre samling av hele blodprøver for vurdering av pulsatile LH utskillelsen mønstre over flere timer i musen, en kraftig dyr modell for neuroendocrine forskning.
Introduction
Gonad-funksjonen i pattedyr er avhengig av gonadotropin sekresjon, luteiniserende hormon (LH) og follicle stimulerende hormone, fra hypofysen. Gonadotropiner utskilles i enten et pulsatile eller bølge mønster svar på hypothalamus utskillelsen av gonadotropin – lanserer hormone (GnRH). Syntese og sekresjon av både LH og FSH er regulert via endokrine, paracrine og autocrine handling fra en rekke molekyler inkludert hypothalamus GnRH, gonadal steroidhormoner, og activin-inhibin-follistatin systemet, i tillegg til en rekke fysiologiske forhold inkludert stress og energi. 2
Pulsatile mønster av LH i blod oppstår heller brå utslipp av LH i perifert blod, etterfulgt av ca eksponentiell eliminering. Viktige funksjoner av mønsteret inkluderer hyppigheten av hver LH utslipp og amplituden til LH svaret, begge dikteres, delvis av utgivelsen av GnRH. forfallsdato på problemer med å samle hypothalamus-hypofyse portalen blod for måling av pulsatile GnRH, prøvetaking og måling av LH brukes som en proxy for GnRH regulering av hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen. Derfor er viktig informasjon kodet i frekvens og amplitude LH pulser, som ikke kan bestemmes fra en enkelt prøve.
Analyse av pulsatile LH utskillelsen har historisk vært begrenset til store pattedyr (mennesker, primater, og sau) på grunn av deres store blodvolum og toleranse for hyppige blod prøvetaking. I Red, hyppige blodprøve var begrenset til rotta og nådd via indwelling atrial kateter. 3 , 4 relativt lave kostnadene og tilgjengeligheten av genetisk (f.eks grobunn-lox, CRISPR) og kompliserte nevrale krets (f.eks optogenetics, chemogenetics) manipulasjoner mus en attraktiv modell organisme; Men, oppnåelse av hyppige blodprøver og påfølgende analyse av LH konsentrasjoner har inntil nylig vist unnvikende. Denne monumentale oppgaven ble utviklet av Steyn og kolleger. 1 siden da, flere labs har begynt å utnytte hyppige blodprøve og ultra-følsom LH analyser å vurdere pulsatile LH utskillelsen i en rekke eksperimentelle paradigmer. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 det bør bemerkes at jakten på en praktisk metode for å ta flere mus har vært i gang for minst 40 år10 med flere forbedringer gjort underveis. 11 , 12
Vurdering av LH puls mønstre (i.e. frekvens og amplitude) representerer en stor raffinement i overvåkning basale gonadotropin sekresjon i denne genetisk medgjørlig dyremodell. Tradisjonelt, var LH konsentrasjoner i mus bestemt i en enkel blodprøve. En svakhet av ett-punkts prøver er et svært variabelt datasett fordi LH konsentrasjoner er naturlig varierende under hver puls. En annen svakhet er at isolert målinger iboende savner kritiske informasjonen mønstre av LH puls sekret. Således, en metode for innsamling av hyppige blodprøver i fritt oppfører seg, uhemmet mus (unntatt skånsom behandling under prøvetaking) vil gi forbedret og være nyttig for mange laboratorier undersøker pulsatile hormon regulering.
Her beskriver vi en protokoll for innsamling av hyppig (hver 6 min) blod prøver fra våken, uhemmet mus. Viktigere, vi inkluderer en håndtering Akklimatisering protokoll som gir robust og kontinuerlig påvisning av pulsatile LH utskillelsen i hele blodprøver samlet over et tidsrom som før og etter vurdering en akutt Challenge kan bestemmes, som svar på psykososiale stress immobilisering og tilbakeholdenhet. En effektiv analysen for LH konsentrasjoner fra hele blodprøver har blitt beskrevet tidligere; 1 denne protokollen er fokusert på en metode for innsamling av blodprøver for LH pulsmåling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for hyppige blod samling av hale-tips-blodprøver fra hele vurdering av pulsatile LH utskillelsen i mus. Dette muliggjør innsamling av prøver for påvisning av akutte endringer i pulsatile LH utskillelsen etter eksponering for psykososial stress og er godt egnet for vurdering av LH pulser under andre akutt eller kronisk manipulasjoner.
En kritisk komponent i denne protokollen for å oppnå driftssikker og robust profiler LH pulser er håndtering Akklimatisering …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Jennifer Yang og Alexander (Sasha) Kauffman for kundestøtte med denne teknikken, samt mange nyttige og viktige diskusjoner. Serum hormon analyser ble utført av Yang et al., 2017 ved University of Virginia Center reproduksjon Ligand analysen og analyse kjernen, støttet av Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Kilder til forskningsstøtte: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM ble støttet av T32 NICHD 007203.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
