Частые проб крови кончик хвоста у мышей для оценки пульсирующего лютеинизирующего гормона
Summary
Здесь мы представляем протокол выборки кончик хвоста крови для частых проб в безудержной мышей. Этот метод полезен для оценки шаблонов пульсирующего лютеинизирующего гормона и могут быть адаптированы для анализа других циркулирующих факторов.
Abstract
В многих эндокринных систем циркулирующих факторов или гормоны не освобождаются непрерывно, но выделяется как дискретный импульс в ответ на освобождение фактор. Одной точки выборки меры недостаточны для полного понимания биологической значимости секреторной шаблон пульсирующего гормонов при нормальных физиологических условиях или в условиях регуляции. Лютеинизирующий гормон (ЛГ) синтезируется клетками передней гипофиза gonadotrope и выделяется в шаблоне пульсирующего, которая требует частого сбора образцов крови для оценки импульса. Это не было возможным в мышей до недавно, благодаря развитию пробирного LH высок чувствительности и улучшения в технике для частых низким объемом проб, первоначально описанные Стейн и коллег. 1 здесь мы описываем протокол для коллекции образцов частыми периферической крови от мышей с достаточной обработки акклиматизации обнаружить пульсирующего секрецию ЛГ. Текущий протокол подробности Расширенный Акклиматизационный период, который позволяет оценки стабильная и непрерывная импульсов ЛГ в течение нескольких часов. В этом протоколе кончик хвоста обрезается и кровь собирается из хвоста, с помощью ручной дозатор. Для оценки пульсирующего LH gonadectomized мышей, серийный образцы, собранные каждые 5-6 мин на 90-180 мин важно, сбор крови и измерение надежные импульсов LH может быть достигнуто в awake, свободно себя мышей, учитывая адекватной обработки Акклиматизация и усилия для сведения к минимуму экологических стрессоров. Достаточные акклиматизация может быть достигнуто в течение 4-5 недель до сбора крови. Этот протокол освещаются успехи в методологии для обеспечения сбора образцов цельной крови для оценки пульсирующего шаблонов секреции ЛГ через несколько часов в мышь, мощный животной модели нейроэндокринной исследований.
Introduction
Гонада функция млекопитающих зависит от секреции гонадотропина, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона, от гипофиза. Гонадотропинов выделяется в либо пульсирующего или защитному шаблон в ответ на гипоталамические секрецию гонадолиберин (GnRH). Синтез и секрецию ЛГ и ФСГ, регулируются через эндокринной и паракринными Аутокринный действий из различных молекул, включая гипоталамуса ГнРГ, половых стероидных гормонов и activin ингибин follistatin системы, а также множество физиологические условия, включая стресс и энергетического баланса. 2
Пульсирующего шаблон ЛГ в крови возникает из довольно резкий сброс LH в периферической крови, следуют примерно экспоненциального ликвидации. Важные особенности структуры включают частоту каждого разряда LH и амплитуда LH ответ, оба из которых диктуются, в частности, освобождение ГнРГ. должное трудности в сборе гипоталамо гипофизарной портала крови для измерения пульсирующего ГнРГ, отбора проб и измерения LH используется в качестве прокси для регулирования GnRH гипоталамо гипофизарно гонадной оси. Таким образом критический информация кодируется в частоты и амплитуды импульсов ЛГ, которые не могут быть определены от одного образца.
Анализ пульсирующего секреции ЛГ исторически была ограничена крупных млекопитающих (людей, приматов и овцы) из-за их объем большой крови и терпимости для сбора образцов частые крови. В грызунов частые крови была ограничена крыса и через обретение предсердий катетер. 3 , 4 относительно низкая стоимость и доступность генетических (например cre-lox, ТРИФОСФАТЫ) и сложные нейронные цепи (например Оптогенетика, chemogenetics) манипуляций сделать мышей организма привлекательная модель; Однако достижение частые крови и последующего анализа концентрации ЛГ до недавно, оказалась недостижимой. Эта монументальная задача был впервые предложен Стейн и коллег. 1 с, то, несколько лабораторий начали использовать частые крови и ультра-чувствительных LH анализов для оценки пульсирующего секреции ЛГ в различных экспериментальных парадигм. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 следует отметить, что преследование практический метод сбора несколько образцов крови от мышей в прогресс для по крайней мере 40 лет10 с несколько уточнений, сделанные по пути. 11 , 12
Оценки структур пульс LH (т.е. частота и амплитуда) представляет основных изысканности в мониторинг базальной гонадотропин секреции в этой генетически шансов справиться с возникающими животной модели. Традиционно концентрации ЛГ в мышей были определены в образце одной крови. Один слабость точечные пробы является очень переменный набор данных, потому что концентрация LH естественно колеблются во время каждого импульса. Еще одним недостатком является, что изолированных измерений изначально пропустить важную информацию, переданное моделей пульс секрецию ЛГ. Таким образом метод для сбора образцов частые крови в свободно себя, безудержной мышей (за исключением Деликатное обращение во время отбора проб) предоставлять более полную информацию и окажется полезным для многих лаборатории изучения пульсирующего гормон регулирования.
Здесь мы описываем протокол для коллекции часто (каждые 6 мин) кровь образцов от бодрствования, необузданный мышей. Важно отметить, что мы включить обработку акклиматизации протокол, который позволяет для надежной и непрерывного обнаружения пульсирующего секреции ЛГ в пробах цельной крови собрали более длиной время до и после оценки острой проблемой может быть определено, Например, ответ психосоциального стресса иммобилизации и сдержанность. Эффективное assay для концентрации ЛГ пробах цельной крови была описана ранее; 1 настоящий Протокол ориентирован на метод для сбора образцов крови для измерения пульса LH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протокол для частых крови коллекции образцов цельной крови кончик хвоста для оценки пульсирующего секреции ЛГ у мышей. Этот протокол позволяет сбор проб для выявления острых изменений в пульсирующего секреции ЛГ, после воздействия психосоциального стресса и хорошо…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Drs. Дженнифер Янг и Кауфман Александр (Саша) для оказания технической помощи с этой техникой, а также многочисленные полезные и критического обсуждения. Сыворотке гормона анализов были исполнены Ян et al., 2017 в университете Вирджинии центр исследований воспроизводства лигандом пробирного и анализ основных, поддерживаемые Юнис Кеннеди Шрайвер NICHD/низ (NCTRI) Грант P50-HD28934.
Источники поддержки исследований: 86100 NICHD R01 (КМБ), УОКР была поддержана T32 NICHD 007203.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
