Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante
Summary
Aquí presentamos un protocolo de muestreo de sangre de la punta de la cola para la recogida de muestras frecuentes en ratones sin restricciones. Este método es útil para evaluar patrones de secreción pulsátil de hormona luteinizante y podría ser adaptado para el análisis de otros factores de circulación.
Abstract
En muchos sistemas endocrinos, circulación factores u hormonas no son liberadas continuamente, pero son secretadas como un discreto impulso en respuesta a un factor de liberación. Muestreo de un solo punto las medidas es insuficiente para comprender el significado biológico del patrón secretor de hormonas pulsátiles bajo condiciones fisiológicas normales o en condiciones de desregulación. La hormona luteinizante (LH) es sintetizada por las células del gonadotrope pituitario anterior y secretada en forma pulsátil que requiere frecuente recolección de muestras de sangre para la evaluación del pulso. Esto no ha sido posible en los ratones hasta que recientemente, debido al desarrollo de un análisis de LH de alta sensibilidad y progreso en una técnica de frecuente recolección de muestras de bajo volumen, inicialmente descrita por Steyn y colegas. 1 aquí se describe un protocolo para la recogida de muestras frecuentes de sangre periférica de ratones con aclimatación de manejo suficiente para detectar la secreción pulsátil de LH. El actual protocolo de detalles de un período de aclimatación ampliada que permite la evaluación de pulsos sólidas y continuadas de LH durante varias horas. En este protocolo, la punta de la cola se recorta y se recoge la sangre de la cola con una pipeta de mano. Para la evaluación de la LH pulsátil en ratones gonadectomized, muestras seriales son recogidos cada 5-6 min. 90-180 minutos, la recolección de sangre y medición de robustos pulsos de LH se pueden lograr en ratones despiertos, comportarse libremente, dados el manejo adecuado aclimatación y el esfuerzo para minimizar los factores de estrés ambientales. Aclimatación suficiente puede lograrse dentro de 4-5 semanas antes de la recogida de sangre. Este protocolo destaca avances en la metodología para recolección de muestras de sangre para la evaluación de los patrones de secreción pulsátiles de LH durante varias horas en el ratón, un modelo animal de gran alcance de investigación neuroendocrina.
Introduction
Función de la gónada en mamíferos depende de la secreción de gonadotropinas, hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante hormona de la glándula pituitaria. Las gonadotropinas son secretadas en un patrón pulsátil o surge en respuesta a la secreción hipotalámica de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). La síntesis y secreción de LH y FSH están reguladas a través de la acción endocrina, paracrina y autocrina de una variedad de moléculas GnRH hipotalámico, las hormonas esteroides gonadales y el sistema inhibina-activina-folistatina, así como una miríada de condiciones fisiológicas incluyendo balance de tensión y energía. 2
El patrón pulsátil de la LH en sangre surge de una descarga más bien abrupta de la LH en sangre periférica, seguida por aproximadamente exponencial eliminación. Importantes características del modelo incluyen la frecuencia de cada descarga de LH y la amplitud de la respuesta de la LH, que son dictadas, en parte, por la liberación de GnRH. debido a la dificultad en la recolección de sangre portal hipotalámico-hipofisario para la medición de GnRH pulsátil, el muestreo y la medición de la LH se utiliza como proxy para la regulación de GnRH del eje hipotalámico-pituitario-gonadal. Por lo tanto, información crítica está codificada en la frecuencia y amplitud de pulsos de LH, que no se puede determinar de una sola muestra.
Análisis de la secreción pulsátil de LH ha sido históricamente limitado a grandes mamíferos (seres humanos, primates y ovejas) debido a su volumen de sangre grande y tolerancia para la recogida de muestras de sangre frecuentes. En roedores, tomar muestras de sangre frecuentes se limitaba a la rata y través de la sonda permanente. 3 , 4 el relativamente bajo costo y la disponibilidad de la genética (por ejemplo, cre-lox, CRISPR) y manipulaciones de circuito neuronales complejas (e.g. optogenetics, chemogenetics) ratones un organismo modelo atractivo; sin embargo, obtención de muestras de sangre frecuentes y posterior análisis de las concentraciones de LH ha hasta recientemente, probado evasivos. Esta tarea monumental fue pionero por Steyn y compañeros de trabajo. 1 desde entonces, varios laboratorios han empezado a utilizar el análisis de LH ultra sensibles para evaluar la secreción pulsátil de LH en una variedad de paradigmas experimentales y tomar muestras de sangre frecuentes. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 cabe señalar que la búsqueda de un método práctico de recoger múltiples muestras de sangre de los ratones ha sido en curso por lo menos 40 años10 con múltiples mejoras a lo largo de la manera. 11 , 12
Evaluación de patrones de pulso de LH (es decir, frecuencia y amplitud) representa un refinamiento importante en la supervisión de la secreción de gonadotropina basal en este modelo animal genéticamente manejable. Tradicionalmente, las concentraciones de LH en ratones se determinan en una muestra de sangre solo. Una debilidad de las muestras de un solo punto es un conjunto de datos altamente variable porque las concentraciones de LH son naturalmente fluctuantes durante cada pulso. Otra debilidad es que las mediciones aisladas inherentemente perder información crítica por los patrones de secreción de pulsos de LH. Por lo tanto, un método para recoger muestras de sangre frecuente en comportarse libremente, ratones sin restricciones (excepto la dirección apacible durante el muestreo) proporcionará mayor información y ser útiles a muchos laboratorios de investigación de la regulación pulsátil de la hormona.
Aquí, describimos un protocolo para la recogida de frecuentes muestras de ratones despiertos, libre de la sangre (cada 6 minutos). Lo importante, incluimos una dirección Protocolo de aclimatación que permite detección sólida y continua de la secreción pulsátil de LH en muestras de sangre entera recogida durante un período de tiempo en el que pre- y post-evaluación un reto agudo puede ser determinado, como la respuesta al estrés psicosocial de inmovilización y sujeción. Un ensayo eficaz para determinar las concentraciones de LH de muestras de sangre entera se ha descrito anteriormente; 1 el presente Protocolo se centra en un método para la recolección de las muestras de sangre para la medición del pulso de LH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un protocolo para recogida de sangre frecuente de muestras de sangre entera cola de punta para la evaluación de la secreción pulsátil de LH en ratones. Este protocolo permite la recogida de muestras para la detección de cambios agudos en la secreción pulsátil de LH después de la exposición a estrés psicosocial y es adecuado para la evaluación de pulsos de LH bajo otras manipulaciones agudas o crónicas.
Un componente fundamental de este protocolo para lograr perfile…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los Drs. Jennifer Yang y Kauffman Alexander (Sasha) para asistencia técnica con esta técnica así como numerosas discusiones útiles y críticas. Análisis de la hormona del suero fueron realizados por Yang et al., 2017 en la Universidad de Virginia centro de investigación en reproducción Ligand análisis y base de análisis, apoyado por Eunice Kennedy Shriver NIH/NICHD (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Fuentes de apoyo a la investigación: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM fue apoyado por T32 NICHD 007203.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
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