Frekventa svans-spetsen blodprovstagning hos möss för bedömning av pulserande luteiniserande hormon
Summary
Här presenterar vi en svans-spetsen blod provtagning protokoll för frekventa provinsamling i ohämmad möss. Denna metod är användbar för bedömningen av mönster av pulserande luteiniserande hormon och kan anpassas för analys av andra cirkulerande faktorer.
Abstract
I många endokrina system, cirkulerande faktorer eller hormoner frigörs inte kontinuerligt, men utsöndras som en diskret puls som svar på en releasing factor. Enpunkts-provtagning åtgärder är otillräckliga till fullo förstå den biologiska betydelsen av sekretoriska mönstret av pulserande hormoner antingen under normala fysiologiska förhållanden eller under förhållanden av dysreglering. Luteiniserande hormon (LH) syntetiseras av främre hypofys gonadotrope celler och utsöndras i en pulserande mönster som kräver frekvent insamling av blodprov för puls bedömning. Detta har inte varit möjligt i möss tills nyligen, på grund av utvecklingen av en hög känslighet LH analys och avancemang i en teknik för frekventa låg volym provtagning, inledningsvis beskrivs av Steyn och kollegor. 1 här beskriver vi ett protokoll för provsamlingen frekvent perifert blod från möss med tillräcklig hantering acklimatisering att upptäcka pulserande utsöndringen av LH. Det nuvarande protokollet Detaljer en utökad acklimatisering period som möjliggör bedömning av robust och kontinuerlig pulser av LH över flera timmar. I detta protokoll, spetsen av svansen klipps och blod som samlas in från svansen med handhållna pipett. För bedömning av pulserande LH i gonadectomized möss, seriell proverna är insamlade varje 5-6 min för 90-180 min. viktigt, insamling av blod och mätning av robust pulser av LH kan åstadkommas i vaken, fritt beter sig möss, ges adekvat hantering acklimatisering och försök att minimera miljöfaktorer. Tillräcklig acklimatisering kan uppnås inom 4-5 veckor innan blodinsamling. Detta protokoll belyser framsteg i metoden för att säkerställa uppbörd av hela blodprov för bedömning av pulserande LH sekretion mönster över flera timmar i musen, en kraftfull djurmodell för neuroendokrina forskning.
Introduction
Gonad funktion hos däggdjur är beroende av gonadotropin sekretion, luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon från hypofysen. Gonadotropiner utsöndras i antingen ett pulserande eller våg mönster som svar på hypotalamus utsöndringen av gonadotropinfrisättande hormon (GnRH). Syntes och sekretion av både LH och FSH regleras via endokrin, parakrin och autokrin handling från en mängd olika molekyler inklusive hypotalamus GnRH, gonadala steroidhormoner, activin-inhibin-follistatin systemet, samt och en myriad av fysiologiska förhållanden inklusive stress och energibalans. 2
Den pulserande mönstret av LH i blodet uppstår ganska abrupt ansvarsfrihet av LH i perifert blod, följt av ungefärligt exponentiell eliminering. Viktiga egenskaper hos mönstret är frekvensen av varje LH ansvarsfrihet och amplituden av LH svar, som båda är betingade, delvis av frisläppandet av GnRH. vederbörlig till svårigheten att samla in hypotalamus-hypofys portal blod för mätning av pulserande GnRH, provtagning och mätning av LH används som proxy för GnRH förordning av den hypotalamus-hypofysaxeln. Därför är kritisk information kodad i frekvens och amplitud av LH pulserar, som inte kan fastställas från ett enda prov.
Analys av pulserande LH-utsöndring har historiskt varit begränsad till stora däggdjur (människor, primater och får) på grund av deras stora blodvolym och tolerans för frekventa blod provinsamling. Hos gnagare, täta blodprov var begränsat till råtta och uppnås via kvarliggande förmaksflimmer katetern. 3 , 4 den relativt låg kostnad och tillgänglighet av genetiska (e.g. cre-lox, CRISPR) och komplex neural krets (e.g. optogenetik, chemogenetics) manipulationer gör möss en attraktiv modellorganism; förverkligandet av täta blodprov och efterföljande analys av LH koncentrationer har dock tills nyligen visat svårfångade. Denna monumentala uppgift var pionjärer av Steyn och medarbetare. 1 sedan sedan, flera labs har börjat utnyttja täta blodprov och ytterst känsliga LH analyser att bedöma pulserande LH sekretion i en mängd olika experimentella paradigm. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 det bör noteras att strävan efter en praktisk metod att samla flera blodprov från möss pågår för minst 40 år10 med flera finesser gjort längs vägen. 11 , 12
Bedömning av LH puls mönster (dvs frekvens och amplitud) representerar en större förfining i övervakning basala gonadotropin sekretion i denna genetiskt eftertraktansvärda djurmodell. Traditionellt, har LH koncentrationer i möss fastställts i ett enda blodprov. En svaghet av enpunkts-prover är en mycket varierande uppsättning data eftersom LH koncentrationer naturligt fluktuerar under varje puls. En annan svaghet är att enstaka mätningar inneboende missar viktig information förmedlas av mönster av LH puls sekretion. Således, en metod för att samla in täta blodprov i fritt bete, ohämmad möss (förutom varsam hantering under provtagning) ger förbättrad information och vara användbara för många laboratorier undersöker pulserande hormon förordning.
Här beskriver vi ett protokoll för insamling av täta (varje 6 min) blod prover från vaken, ohämmad möss. Ännu viktigare, inkluderar vi en hantering acklimatisering protokoll som möjliggör robust och kontinuerlig detektering av pulserande LH sekretion i helblod prover som samlats in under en tidsperiod där före och efter bedömning på en akut utmaning kan bestämmas, såsom svar på psykosociala stress immobilisering och återhållsamhet. Ett effektivt test för LH koncentrationer från helblod prover har beskrivits tidigare; 1 detta protokoll är inriktad på en metod för att samla in blodprover för LH puls mätning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för frekventa blodinsamling av helblod svans-spetsen prov för bedömning av pulserande LH sekretion hos möss. Detta protokoll möjliggör insamling av prover för att upptäcka akuta ändringar i pulserande LH-utsöndring efter exponering för psykosociala stress och är väl lämpad för bedömning av LH pulser under andra akuta eller kroniska manipulationer.
En kritisk komponent i detta protokoll för att uppnå tillförlitliga och robusta profiler av LH pu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Drs. Jennifer Yang och Alexander (Sasha) Kauffman för tekniskt bistånd med denna teknik samt många hjälpsamma och kritiska diskussioner. Serum hormon analyser utfördes av Yang et al., 2017 på det Universitetar av Virginia Center för forskning i reproduktion Ligand analys och analys kärna, stöds av Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Källor för forskningsstöd: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM stöddes av T32 NICHD 007203.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
