Frequente staart-tip bloedmonsters in muizen voor de beoordeling van Pulsatiele luteïniserend hormoon afscheiding
Summary
Hier presenteren we een staart-tip bloed bemonstering protocol voor frequente sample collectie in ongebreidelde muizen. Deze methode is nuttig voor het beoordelen van patronen van Pulsatiele luteïniserend hormoon afscheiding en voor analyse van andere circulerende factoren zou kunnen worden aangepast.
Abstract
In vele endocriene systemen, circulerende factoren of hormonen niet continu worden vrijgegeven, maar als een afzonderlijke puls in reactie op een releasing factor worden uitgescheiden. Single-point bemonstering maatregelen zijn ontoereikend is om de biologische betekenis van de secretoire patroon van Pulsatiele hormonen in normale fysiologische omstandigheden of onder vervoersomstandigheden disregulatie volledig te begrijpen. Luteïniserend hormoon (LH) wordt gesynthetiseerd door de anterieure hypofyse de gonadotrope cellen en uitgescheiden in een Pulsatiele patroon waarvoor frequente verzameling van bloedmonsters voor beoordeling van de pols. Dit niet mogelijk is geweest in muizen totdat onlangs, als gevolg van de ontwikkeling van een hoog-gevoeligheids LH-test en vooruitgang in een techniek voor frequente laag-volume sample collectie, oorspronkelijk beschreven door Steyn en collega’s. 1 hier beschrijven we een protocol voor de frequente perifeer bloed monster collectie van muizen met voldoende behandeling acclimatisatie te detecteren Pulsatiele secretie van LH. Het huidige protocol gegevens een uitgebreide acclimatisatie periode waarmee beoordeling van robuust en continue pulsen van LH over meerdere uren. In dit protocol, het puntje van de staart is geknipt en bloed wordt verzameld uit de staart met behulp van een precisiepipet hand-held. Voor de beoordeling van Pulsatiele LH in gonadectomized muizen, seriële monsters worden verzameld elke 5-6 min voor 90-180 min. nog belangrijker is, de inzameling van bloed en meting van robuuste pulsen van LH kunnen worden bereikt in wakker, vrij gedragend muizen, passende behandeling gegeven acclimatisatie en inspanning om te minimaliseren milieustressoren. Voldoende acclimatisatie kan binnen 4-5 weken voorafgaand aan de bloedinzameling worden bereikt. Dit protocol onderstreept voorschotten in de methodologie om bloed monsters voor evaluatie van Pulsatiele LH secretie patronen over meerdere uren in de muis, een krachtige diermodel voor neuro-endocriene onderzoek.
Introduction
Gonaden functie bij zoogdieren is afhankelijk van choriongonadotrofine secretie, luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon, uit de hypofyse. De gonadotrofinen worden uitgescheiden in een gepulseerde of Golf patroon in reactie op de hypothalamische secretie van gonadotropin – releasing hormone (GnRH). De synthese en secretie van zowel LH als FSH worden geregeld via een actie van de verstoringen van de hormoonhuishouding, paracrine en autocrine uit een aantal moleculen met inbegrip van hypothalame GnRH, gonadale steroïde hormonen, en de activin-inhibine-follistatin systeem, evenals een groot aantal fysiologische omstandigheden, waaronder stress en energiebalans. 2
Het Pulsatiele patroon van LH in het bloed vloeit voort uit een nogal abrupte lozing van LH in perifeer bloed, gevolgd door ongeveer exponentiële eliminatie. Belangrijke kenmerken van het patroon zijn de frequentie van elke LH kwijting en de amplitude van de LH-reactie, die beide worden gedicteerd, gedeeltelijk door de release van GnRH. Due to de moeilijkheid bij het verzamelen van hypothalame-hypofyse portal bloed voor meting van Pulsatiele GnRH, de monsterneming en de meting van het LH wordt gebruikt als een proxy voor GnRH regulering van de hypothalamische-hypofyse-gonadale as. Daarom is kritieke informatie gecodeerd in de frequentie en amplitude van LH pulsen, die uit een enkelvoudige steekproef kan niet worden bepaald.
Analyse van Pulsatiele LH secretie van oudsher beperkt tot grote zoogdieren (mens, primaten en schapen) te wijten aan hun grote bloed volume en tolerantie voor frequente bloed monster collectie. Bij knaagdieren, frequente bloedmonsters was beperkt tot de rat en bereikt via inwoning atriale katheter. 3 , 4 de relatief lage kosten en beschikbaarheid van genetische (bijvoorbeeld cre-lox, CRISPR) en complexe neurale (b.v. optogenetics, chemogenetics) manipulaties maken muizen een aantrekkelijk model-organisme; verwezenlijking van frequente bloedmonsters en na diverse analyses van LH concentraties heeft echter tot onlangs bewezen ongrijpbaar. Deze monumentale taak was gepionierd door Steyn en collega’s. 1 sinds dan, verschillende labs zijn begonnen om frequente bloedmonsters en ultra gevoelige LH-testen om te beoordelen Pulsatiele LH secretie in een verscheidenheid van experimentele paradigma’s te gebruiken. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 opgemerkt moet worden dat het nastreven van een praktische manier van het verzamelen van meerdere bloedmonsters van muizen is geweest in de vooruitgang van ten minste 40 jaar10 met meerdere verfijningen gemaakt langs de weg. 11 , 12
Beoordeling van LH pulse patronen (d.w.z. frequentie en amplitude) vertegenwoordigt een grote verfijning bij het toezicht op basale gonadotrofinen secretie in dit genetisch hanteerbare diermodel. Traditioneel, werden LH concentraties in muizen vastgesteld in een enkel bloedmonster. Een zwak punt van single-point monsters is een zeer variabel gegevensverzameling omdat LH concentraties natuurlijk tijdens elke puls schommelt zijn. Een ander zwak punt is dat geïsoleerd metingen inherent kritische informatie die door de patronen van de LH secretie van de pols missen. Dus, een methode voor het verzamelen van frequente bloedmonsters in vrij gedraagt, ongebreidelde muizen (met uitzondering van zachte behandeling gedurende de bemonstering) zal voorzien van uitgebreide informatie en nuttig zijn voor veel laboratoria onderzoeken Pulsatiele hormoon verordening.
Hier beschrijven we een protocol voor het verzamelen van frequente (elke 6 min) bloed monsters van wakker, ongebreidelde muizen. Nog belangrijker is, ook een afhandeling acclimatisatie protocol waarmee robuuste en continu detectie van Pulsatiele LH secretie in volbloed monsters verzameld een lengte van tijd waarin pre-en post beoordeling aan een acute uitdaging kan worden vastgesteld, zoals de reactie op de psychosociale stress van immobilisatie en terughoudendheid. Een effectieve assay voor LH concentraties van monsters van volbloed is bestempeld eerder; 1 die dit protocol is gericht op een methode voor het verzamelen van de bloedmonsters voor LH polsmeting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor frequente bloedinzameling volbloed staart-tip monsters voor evaluatie van Pulsatiele LH secretie in muizen. Dit protocol maakt het verzamelen van monsters voor detectie van acute veranderingen in Pulsatiele LH secretie na blootstelling aan psychosociale stress en is geschikt voor de beoordeling van LH pulsen onder andere acute of chronische manipulaties.
Een essentieel onderdeel van dit protocol voor het bereiken van betrouwbare en robuuste profielen van L…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Drs. Jennifer Yang en Alexander (Sasha) Kauffman voor technische bijstand met deze techniek, evenals tal van nuttige en kritische discussies. Serum hormoon tests werden uitgevoerd door Yang et al., 2017 bij de Universiteit van Virginia Center for Research in reproductie Ligand Assay en analyse Core, ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Bronnen van steun voor onderzoek: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM’s werd gesteund door T32 NICHD 007203.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
