Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

Summary

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie ein Modell mit niedriger Auflösung ab-initio und Strukturdetails Waschmittel solubilisiert Membranprotein in Lösung mit kleinen Winkel Neutronenstreuung mit Kontrast-matching des Waschmittels zu erhalten.

Abstract

Das biologische Small-Angle Neutron Streuung Instrument in der High-Flux-Isotope Reaktor des Oak Ridge National Laboratory ist widmet sich der Erforschung der biologischen Materialien, Biokraftstoff, die Verarbeitung und Bioinspirierte Materialien für Nanometer Mikrometer Längenskalen. Für die Untersuchung der physikalischer Eigenschaften (z.B. Größe und Form) von Membranproteinen hier vorgestellten Methoden (hier, MmIAP, eine Intramembrane Aspartyl-Protease aus Methanoculleus Marisnigri) in Lösungen von Micelle bildenden Reinigungsmittel sind gut geeignet für dieses kleine Winkel Neutronen-Streuung Instrument, unter anderem. Ndere biophysikalische Charakterisierung sind durch ihre Unfähigkeit, die Waschmittel Beiträge in einer komplexen Struktur von Protein-Reinigungsmittel Adresse behindert. Darüber hinaus bietet Zugriff auf die Bio-Deuterierung Labor einzigartige Fähigkeiten für die Vorbereitung der großflächige Anbau und Deuterium-markierten Proteine für verbesserte streusignal aus dem Protein zum Ausdruck zu bringen. Während diese Technik bietet keine strukturelle Details in hoher Auflösung, die strukturelle Wissenslücke für Membranproteine enthält viele adressierbare Bereiche der Forschung ohne in der Nähe von atomarer Auflösung. Beispielsweise enthalten diese Bereiche Bestimmung der Oligomere Staaten, Komplexbildung, Konformationsänderungen bei Störung und Faltung/Entfaltung Ereignisse. Diese Untersuchungen können leicht durch Anwendungen dieser Methode erreicht werden.

Introduction

Membranproteine sind um schätzungsweise 30 % aller Gene¹ codiert und repräsentieren eine deutliche Mehrheit der Ziele für die modernen Arzneimitteln. ² diese Proteine führen eine Vielzahl von lebenswichtigen Zellfunktionen,³ aber trotz ihrer Fülle und ihrer Bedeutung – nur etwa 1 % der gesamten Strukturen hinterlegt in der Forschung Collaboratory für strukturelle Bioinformatik (RCSB) Protein darstellen Daten Bank. ⁴ aufgrund ihrer teilweise hydrophoben Natur, Strukturaufklärung von Proteinen, Membrane-springen überaus schwierig wurde. ^{5 , 6 , 7}

Wie viele biophysikalische Techniken Monodisperse Partikel in Lösung für die Messung erforderlich, wurde Membranproteine von native Membranen zu isolieren und stabilisiert diese Proteine in eine lösliche Mimik der native Membranen ein aktives Gebiet der Forschung in den letzten Jahren Jahrzehnten. ^{8 , 9 , 10} diese Untersuchungen zur Entwicklung der vielen neuartigen AMPHIPHILE Baugruppen führten zu solubilisieren Membranproteine, wie Nanodiscs,^11,12,13 Bicelles^14,15 und Amphipols. ^{16 , 17} bleibt jedoch die Verwendung von Reinigungsmittel Micellen einer der am weitesten verbreitete und einfache Ansätze für die Erfüllung der Anforderungen der Löslichkeit eines gegebenen Proteins. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} leider gibt es kein einziges Reinigungsmittel oder magische Mischung von Reinigungsmitteln derzeit, die alle Membranproteine gerecht wird; Diese Bedingungen müssen daher empirisch für die individuellen Anforderungen jedes Protein kontrolliert werden. ^{26 , 27}

Reinigungsmittel selbst-zusammenbauen in Lösung über ihre kritischen Micelle Konzentration zu aggregieren Strukturen Mizellen genannt. Mizellen bestehen aus vielen Waschmittel Monomere (in der Regel im Bereich von 20-200) mit hydrophoben Alkyl-Ketten bilden eine Micelle Kern- und hydrophilen Kopfgruppen angeordnet in einem Micelle Shell Layer mit Blick auf das wässrige Lösungsmittel. Das Verhalten von Waschmitteln und Micelle Bildung wurde von Charles Tanford in Der hydrophobe Effekt,²⁸ und Größen klassisch beschrieben und Formen von Micellen aus häufig verwendeten Reinigungsmittel in Membran-Protein-Studien wurden mit kleinen Winkel Streuung charakterisiert. ^{29 , 30} Waschmittel Organisation über Membranproteine wurde ebenfalls untersucht, und die Bildung von Protein-Reinigungsmittel-komplexen (PDCs) dürfte mit Waschmittel Moleküle, die rund um das Protein in einer Anordnung, die das ordentliche Waschmittel ähnelt Mizellen. ³¹

Eine hinzugefügte Vorteil bei der Verwendung von Reinigungsmitteln ist, dass die resultierenden Micelle Eigenschaften bearbeitet werden können, durch die Integration von anderen Waschmitteln. Viele Waschmittel weisen ideale mischen, und wählen Sie Eigenschaften von gemischten Micellen können sogar vorhergesagt werden, von den Komponenten und Verhältnis zu mischen. ²² jedoch kann das Vorhandensein von Waschmittel noch für biophysikalische Charakterisierungen Herausforderungen beitragen, das gesamte Signal. Signal von Waschmittel in der PDC ist beispielsweise mit Röntgen- und Lichtstreuung Techniken, praktisch nicht von Protein. ³² Untersuchungen mit einzelnen Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) verlassen in der Regel auf eingeschlossene Partikel (gefroren); strukturelle Details des Proteins sind noch verdeckt durch bestimmte Reinigungsmittel oder eine hohe Konzentration des Reinigungsmittels, der Hintergrund verleiht. ³³ alternative Ansätze zur Interpretation der vollen PDC-Struktur (inklusive Waschmittel) durch Berechnungsmethoden wurden unternommen, die darauf abzielen, das Waschmittel um einen bestimmten Membranprotein zu rekonstruieren. ³⁴

Für den Fall der Neutronenstreuung produziert die Kern-Schale-Anordnung der Reinigungsmittel in der Micelle einen Formfaktor die beobachtete Streuung beiträgt. Glücklicherweise können Lösungskomponenten geändert werden, so dass sie nicht zu den net beobachtete Streuung beitragen. Dabei “Kontrast passend” erfolgt durch Substitution von Deuterium für Wasserstoff, eine Streuung Länge Dichte zu erreichen, die den Hintergrund (Puffer) übereinstimmt. Eine vernünftige Auswahl an Reinigungsmittel (mit verfügbaren deuterierte Gegenstücke) und ihr Verhältnis zu mischen müssen berücksichtigt werden. Für Waschmittel Micellen kann diese Substitution mit einem Waschmittel mit der gleichen Kopf Gruppe aber eine deuterierte Alkyl Kette (d-Tail statt h-Tail) durchgeführt werden. Da das Waschmittel gut gemischt sind,³⁵ ihrer Aggregate haben eine Streuung Länge Dichte, die Mole-Fraktion gewichtete Durchschnitt der beiden Komponenten (h-Schwänzen und d-Tails). Wenn diese durchschnittliche Kontrast mit derjenigen der Kopfgruppe konsistent ist, können einheitlichen aggregierten Strukturen voll abgestimmt werden, um alle Beiträge zu beobachtete Streuung zu entfernen.

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um das Neutron Kontrast von Waschmittel Micellen zu manipulieren, durch den Einbau von chemisch identisch Waschmittel Moleküle mit Deuterium-Label Alkyl-Ketten. ^{19 , 36 , 37} das komplette Simultankontrast Anpassung der Micelle Kern und Schale, die eine einzigartige Fähigkeit der Neutronenstreuung ist erlaubt. ^{35 , 38} mit dieser deutlich verfeinert Detailebene, passender Kontrast aktivieren kann sonst nicht machbar Studien von Membran-Protein-Strukturen. Darüber hinaus könnte dieser Kontrast-matching-Ansatz auf andere Systeme mit Waschmittel wie Polymer Austausch Reaktionen³⁹ und Öl-Wasser-Dispergiermittel,⁴⁰ oder sogar andere solubilizing Mittel, wie Bicelles,⁴¹ ausgeweitet werden Nanodiscs,⁴² oder Block-Copolymere. ⁴³ A ähnlicher Ansatz wie in dieser Handschrift, aber mit einer einzigen Waschmittel Spezies mit teilweise Deuterium Substitutionen auf die Alkylgruppe Kette und/oder Kopf wurde vor kurzem veröffentlicht. ³⁷ während dies erwartet werden kann, um die zufällige Verteilung von Wasserstoff und Deuterium in das Waschmittel zu verbessern im Vergleich zu der hier vorgestellte Ansatz der begrenzten Anzahl der verfügbaren Positionen auf das Waschmittel für Substitution und in zwei Schritten Waschmittel Synthese benötigt zusätzliche Herausforderungen für die Prüfung.

Schritte 1 und 2 des Protokolls unten oft überschneiden sich da erstes Experiment Planung erfolgen muss, um eine Qualität Vorschlag zu unterbreiten. Antragstellung gilt jedoch hier als der erste Schritt zu betonen, dass dieser Prozess im Vorfeld ein Neutron-Experiment gestartet werden soll. Anzumerken ist, dass ein erforderlicher Schritt, der durch den Vorschlag nachgewiesen werden sollte, ist, biochemischen und physikalischen Charakterisierung (einschließlich Reinheit und Stabilität) der Probe die Notwendigkeit Neutron Untersuchungen zu unterstützen. Eine allgemeine Diskussion über kleine Winkel Neutronen-Streuung (SANS) sprengt den Rahmen dieses Artikels. Eine kurze, aber gründliche Einführung gibt es in der Referenzarbeit, die Charakterisierung der Materialien von Kaufmann,⁴⁴ und eine umfassende Lehrbuch konzentrierte sich auf biologische kleine Winkel Lösung Streuung vor kurzem veröffentlicht worden. ⁴⁵ weitere Buchempfehlungen ist im Abschnitt Diskussion gegeben. Kleine Winkel Streuung verwendet die so genannten Streuung Vektor Q als zentrale Menge, die die Streuung Prozess beschreibt. Dieser Artikel verwendet die allgemein akzeptierte Definition Q = 4π Sünde (θ) / λ, wo θ halbe Winkel zwischen eingehenden und verstreuten Strahl und λ ist ist die Wellenlänge der Neutronenstrahlung in Angström. Andere Definitionen existieren, verwenden Sie verschiedene wie z. Symbole b. die “für die Streuung Vektor, und dass durch einen Faktor 2π oder mithilfe von Nanometern anstelle von Angstrom abweichen kann (siehe auch Diskussion der Abbildung 10).

Protocol

1. vorbereiten und ein Neutron Facility Strahlzeit und Instrument Vorschlag einreichen Finden Sie Online-Ressourcen zur Identifizierung von Neutronen-Streuung Einrichtungen, die allgemeine Neutron Lichtstrahl Zeit Benutzerzugriff, wie Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Eine Karte der Neutron-Einrichtungen und Informationen über Neutronenforschung weltweit ist online verfügbar. Beachten Sie 46 , dass diese Einrichtungen in der Regel regelmäßige Aufforderungen zur Einreichung von Vo…

Representative Results

Ein Strahl Zeit und Instrument Vorschlag sollte eindeutig vermitteln alle Informationen benötigt, um die Review Committee, dass eine gültige vorgeschlagene Experiment beurteilt werden können. Kommunikation mit einem NSS ist für unerfahrene Anwender dringend empfohlen. Die NSS kann erste Machbarkeit und Führer Antragstellung, Machbarkeit, Sicherheit und das Potenzial für hohe Schlagzähigkeit Wissenschaft betonen beurteilen. Die Angaben in dem Vorschlag gehören Hintergrundinformatio…

Discussion

Strukturbiologie Forscher nutzen Sie ergänzende strukturelle Techniken wie Lösung Streuung, Biochemische und strukturelle Details (z. B. Größe und Form) von Biomolekülen in Lösung zu erhalten. SANS ist eine besonders attraktive Technik zur Bestimmung geringer Auflösung Strukturen von Membranproteinen, ein Schwerpunkt der modernen Strukturbiologie und Biochemie. SANS erfordert Mengen der gereinigten Proteine vergleichbar mit denen von kristallographischen Studien (1 mg/Probe). Die vor kurzem wachsende kommerzielle …

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator	EMD Millipore	UFC905096	labware
Ammonium citrate dibasic	Fisher Scientific	A663	medium component
Ammonium sulfate	EMD Millipore	2150	medium component
Bioflo 310 Bioreactor System	Eppendorf	M1287-2110	equipment
Calcium chloride dihydrate	Acros	423525000	medium component
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	antibiotic
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	antibiotic
Cobalt (II) chloride	Acros	AC21413-0050	medium component
Copper (II) sulfate	Acros	AC19771-1000	medium component
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	756822	medium component
Drierite Gas Purifier	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA, disodium, dihydrate	EMD Millipore	4010	medium component
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	equipment
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		equipment
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	medium component
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17116701
Imidazole	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
Iron(III) chloride hexahydrate	MP Biochemicals	ICN19404590	medium component
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-134	medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate	Acros	AC20590-5000	medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000-7	equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
Potassium phosphate monobasic	VWR	97062-346	medium component
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free	Sigma-Aldrich	S8830
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907	medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane	VWR	28145-501	labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane	Thermo Scientific	596-4520	labware
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL column	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter	GE Healthcare	80211630	equipment
Zinc sulfate monohydrate	Acros	AC38980-2500	medium component